鐘抒苡 劉壽榮

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) (浙江 杭州， 310053) 2.杭州市西溪醫(yī)院

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題，可引起慢性乙型肝炎(CHB)和進行性肝纖維化等肝病，并可能導(dǎo)致肝硬化和肝細胞癌，是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的主要原因。雖然抗病毒治療的目標(biāo)是長期抑制血清HBV DNA，但任何抗病毒治療的最大問題是耐藥性的選擇和潛在的交叉耐藥性。準(zhǔn)種概念的提出，使我們對抗病毒治療有了一個全新的方向。這對于慢性乙型肝炎患者的長期治療和患者管理尤為重要。本文就抗病毒治療后HBV準(zhǔn)種動態(tài)變化及不同感染下的演變過程作一綜述。

1 HBV準(zhǔn)種的概念

盡管是一種DNA病毒，HBV使用前基因組RNA作為復(fù)制中間體。此外，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對能力，導(dǎo)致復(fù)制過程中發(fā)生突變和遺傳變異。因此，HBV作為一種病毒種群在體內(nèi)循環(huán)，這種病毒具有一系列基因不同但密切相關(guān)的變異，稱為準(zhǔn)種[1](QS)。HBV的準(zhǔn)種特性意味著在特定環(huán)境下任何新產(chǎn)生的具有選擇性優(yōu)勢的突變都將超越其他變異，成為繼經(jīng)典變異之后的優(yōu)勢準(zhǔn)種達爾文進化過程。HBV是一種被包膜的小病毒，部分雙鏈DNA基因組長度約為3.2 kb。最初的研究將基因組劃分為4個開放讀碼框架(ORF)，分別命名為S、C、P、X區(qū)，4個ORF中表達的氨基酸長度不同，其生物學(xué)功能也不相同。準(zhǔn)種概念強調(diào)的是同一患者血清中病毒之間的遺傳相似性、微小差別、病毒群和動態(tài)變化等4個要素對HBV存在狀態(tài)的認(rèn)識產(chǎn)生了從單一病毒到病毒群、從靜態(tài)到動態(tài)變化的兩次飛躍[2]。

2 抗病毒藥物治療

HBV感染仍然是一個主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，約30%的肝硬化和45%的肝細胞癌病例是由HBV感染引起的[3]。病毒和宿主因素在持續(xù)HBV感染的建立和維持中都起著重要作用。HBV基因組形成一個穩(wěn)定的小染色體-共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA) -在肝細胞的細胞核內(nèi)或整合到宿主基因組中，從而使感染持續(xù)[4]。此外，HBV能夠抑制抗病毒免疫反應(yīng)[5，6]，持續(xù)暴露于高載量和高蛋白濃度的HBV可能導(dǎo)致T細胞功能受損或衰竭，導(dǎo)致免疫逃逸[7,8]。有研究表明，抗病毒藥物可以抑制HBV復(fù)制，延緩疾病進展，改善CHB患者的疾病預(yù)后[9,10]。目前批準(zhǔn)的慢乙肝抗病毒藥物包括免疫調(diào)節(jié)劑(如PEG-IFN)以及直接作用于病毒復(fù)制周期不同靶點的DAA(如NA)。

2.1 乙型肝炎病毒流行株全基因的克隆與序列分析 Liang等[11]從2株慢性乙型病毒性肝炎患者的血清提取DNA，應(yīng)用L-PCR技術(shù)克隆、擴增HBVDNA的全基因組序列，克隆獲得的5個HBVDNA全基因序列分別為G376-A6、G683-A1、G683-A2和G683-A3，全基因序列長度分別為3125、3215、3213、3182和3215堿基對(bp)。其中G376-A6、G376-A7來源于同一個患者，G683-A1、G683-A2、G683-A3來源于另一個患者。G376-A6、G683-A2兩株病毒在前-S1區(qū)存在缺失突變區(qū)。其中G683-A2的羧基末端存在缺失突變，來源于不同患者的e核心抗原蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列沒有顯著的差別，但來源于同一個患者的HBV基因序列有著明顯的同源性。G376-A6、G683-A2兩株病毒存在多聚酶蛋白區(qū)的缺失突變，但不在多聚酶蛋白的活性結(jié)構(gòu)區(qū)，因此考慮這種形式的突變尚不會影響到多聚酶的活性。G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在較長的缺失突變區(qū)，使其多聚酶區(qū)結(jié)構(gòu)被破環(huán)。5株病毒的X蛋白的一級結(jié)構(gòu)序列比較的結(jié)果說明其高度保守。但是相對來講，X蛋白的羧基末端更為保守，羧基末端序列有一定程度的變異。

2.2 核苷(酸)類似物抗病毒治療與準(zhǔn)種動態(tài)變化 臨床上目前使用的NA有拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、富馬酸替諾福韋酯(TDF)、富馬酸丙酚替諾福韋片(TAF)。它可以抑制HBV DNA聚合酶活性，抑制HBV復(fù)制初始患者治療，強調(diào)選擇強效低耐藥藥物，推薦ETV、TDF、TAF。這些抗病毒藥物的使用，使得HBV在機體的環(huán)境更為復(fù)雜多變，不管是準(zhǔn)種優(yōu)勢株還是劣勢株都處在不斷適應(yīng)環(huán)境而進化著，最終導(dǎo)致病毒對抗病毒藥物的敏感性降低[12]。Chen等[13]研究RT區(qū)HBV準(zhǔn)種的動態(tài)變化在LAM期有應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間表現(xiàn)的模式，用PCR方法鑒定陽性克隆,研究發(fā)現(xiàn)LAM治療前4周準(zhǔn)種復(fù)雜性和多樣性的動態(tài)變化與短期抗病毒療效相關(guān)。劉斌等[14]研究ADV抗乙肝病毒治療對HBV準(zhǔn)種變異的影響，采用Pearson相關(guān)檢驗分析HBV DNA水平與準(zhǔn)種復(fù)雜性和多樣性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ADV抗乙型肝炎病毒治療能使HBV準(zhǔn)種變異，其中服用ADV對P區(qū)準(zhǔn)種變異的數(shù)量影響較大，但ADV對其C區(qū)的作用效果并不明顯。黃文勛等[15]研究經(jīng)LdT治療后的慢性乙型肝炎患者的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的準(zhǔn)種模式和動態(tài)變化，在此研究中，使用離子流測序技術(shù)，研究經(jīng)LdT單藥物治療后的21位CHB患者HBV準(zhǔn)種變化，總結(jié)揭示了經(jīng)LdT治療24周的HBV RT區(qū)域準(zhǔn)種的動態(tài)變化過程，發(fā)現(xiàn)了HBV RT區(qū)域準(zhǔn)種的復(fù)雜性和多樣性在完全病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng)組和部分應(yīng)答/無應(yīng)答組之間無明顯的差別。但由于治療群體大和治療時間過長導(dǎo)致藥物作用不佳與耐藥患者逐漸增多。劉斐等[16]研究ETV抗病毒患者乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄區(qū)準(zhǔn)種動態(tài)演變規(guī)律，應(yīng)用巢氏PCR進行擴增，分析各種病毒株所占比例在不斷發(fā)生變化，野生株在抗病毒之前是絕對優(yōu)勢株，出現(xiàn)病毒學(xué)突破時，耐藥突變株成為種群中的優(yōu)勢株，在ETV抗病毒藥物壓力下，CHB患者HBV RT區(qū)準(zhǔn)種分布處于動態(tài)變化中，準(zhǔn)種變化與ETV抗病毒藥物敏感性以及耐藥性密切相關(guān)，rtM204I/V+Tl180M+rtT184L是與ETV耐藥相關(guān)的主要變異模式。HBV準(zhǔn)種的動態(tài)變化可能與長期耐藥和敏感性有關(guān)。

2.3 干擾素治療與準(zhǔn)種動態(tài)變化 干擾素通過增強免疫細胞功能和促進細胞因子的表達、誘導(dǎo)干擾素刺激基因(ISGs)的產(chǎn)生并經(jīng)干擾素信號通路編碼多種抗病毒蛋白等環(huán)節(jié)作用于HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等重要生物學(xué)過程，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重作用[17]。傳統(tǒng)的IFN-a和peg-IFN-a已被批準(zhǔn)用于治療CHB。傳統(tǒng)的IFN-α治療慢性乙型肝炎的療效一般。與常規(guī)IFN-α治療相比，peg-IFN-α治療的HBeAg血清轉(zhuǎn)化、HBV DNA抑制和生化反應(yīng)均更高[18]。幾項關(guān)鍵的國際多中心隨機對照臨床試驗表明，對于接受pegIFN-α-2α治療48周(180 mg/周)的HBeAg陽性患者，其HBeAg血清轉(zhuǎn)陰率為32%;基線ALT為2～53 ULN和基線ALT為5～103ULN的患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換率分別為44.8%和61.1%;停藥后24周，HBsAg血清轉(zhuǎn)換率分別為2.3%～3%。研究還表明，對于HBeAg陽性的CHB患者，peg-IFNα-2b能夠產(chǎn)生類似的HBV DNA抑制、HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和HBsAg清除率;在停藥3年后，HBsAg清除率為11%在接受48周peg-IFN-α-2α治療的HBeAg陰性CHB患者(60%的亞洲人)中，43%的患者在治療后24周HBV DNA <2 000 IU/ml,42%在治療結(jié)束后48周;治療結(jié)束后24周，HBsAg清除率為3%，治療3年后上升至8.7%，治療5年后進一步上升至12%[19]。也有研究證實延長治療至2年可以提高有效率[20，21]。Yang等[22]研究35名HBeAg陽性CHB兒童，包括18例HBsAg血清轉(zhuǎn)化者和17例非血清轉(zhuǎn)化者，接受48周Peg-IFN-α-2a治療。在治療前和治療12周和24周采集血清樣本。對基礎(chǔ)核心啟動子/前核(BCP/PC)和S/逆轉(zhuǎn)錄酶(S/RT)區(qū)域的序列進行下一代測序分析。數(shù)據(jù)顯示，在使用Peg-IFN-α-2a治療的HBeAg陽性CHB兒童中，基線病毒突變和BCP/PC區(qū)域內(nèi)HBV QS(準(zhǔn)物種)多樣性的動態(tài)變化與HBsAg血清轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。但從藥物經(jīng)濟學(xué)的角度來看，由于副作用增加和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)加重，現(xiàn)階段不建議延長治療。

3 HBV準(zhǔn)種在不同感染下的演變過程

3.1 乙型肝炎病毒準(zhǔn)種多樣性增加與肝纖維化進展相關(guān) Wu等[23]共納入447例初治HBV感染患者，其中IT患者9例，LC患者104例，HCC患者104例，239例CHB患者根據(jù)肝纖維化評分分為F1、F2、F3組，采用實時熒光定量PCR檢測HBV DNA水平，擴增了HBV基因pre-S(nt2814-75)、S(nt368-827)、基礎(chǔ)核心啟動子和preore(BCP/PC,nt1607-2068)和core(nt1996-2455)基因的4個片段，估算不同纖維化階段宿主體內(nèi)的病毒核苷酸多樣性、突變率和選擇壓力。發(fā)現(xiàn)患者間點突變在BCP/PC區(qū)、C1653T/T1753V、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A差異顯著。這些突變的頻率隨年齡增加而增加，并與晚期肝病相關(guān)。具體來說，A1762T和G1764A突變隨著患者病情進展而增加，并且這些變異積累到個體患者的大部分病毒準(zhǔn)種池中。A1762T/G1764A和G1896A突變通過減少或消除HBeAg的產(chǎn)生，在HBeAg陰性的慢性HBV感染中發(fā)揮主要作用。血清HBeAg可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而胞漿HBeAg作為炎癥免疫反應(yīng)的靶點[24]。HBeAg陰性變異可能比野生型HBV具有選擇性優(yōu)勢，因為在慢性HBV感染期間，表達野生型HBV的肝細胞比僅表達HBcAg的肝細胞更容易受到免疫清除[25]。慢性感染期間的損傷會增加肝細胞的更替，誘導(dǎo)纖維化，并增加肝細胞轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的機會[26]。研究表明，A1762T/G1764A和G1896A突變對慢性HBV感染患者HCC和急性-慢性肝功能衰竭發(fā)展的影響[27]。隨著年齡的增長，BCP/PC區(qū)域的突變也增加，增加了準(zhǔn)種的多樣性。在HBV中，前s結(jié)構(gòu)域經(jīng)過了嚴(yán)格的選擇，而重疊的間隔域相對寬松，對dN/dS比值高的非同義突變具有明顯的耐受性。這可能是因為前s基因與功能相關(guān)性較低的間隔域存在大量重疊。因此，前s基因的進化受到基因重疊的影響較小。本研究表明，早期CHB患者的突變比例和頻率較高。在免疫選擇下，HBV準(zhǔn)種多樣性隨著患者年齡的增加而增加，纖維化也隨之進展。早期CHB患者，如IT，可能已經(jīng)經(jīng)歷了低級別肝炎癥的發(fā)病機制，導(dǎo)致多年損害后的終末期肝病。因此，慢性HBV感染患者應(yīng)盡早接受治療，以抑制病毒的復(fù)制和多樣性，防止肝病進展，從而防止HCC的發(fā)生。

3.2 肝硬化患者血清HBV準(zhǔn)種特點分析 張欣欣等[28]將50例未接受抗病毒治療的HBV感染者納入研究，分為慢性HBV攜帶組(ASC,10例)、慢性乙型肝炎組(CHB,30例)和慢性乙型肝炎肝硬化組(LC,10例)。收集患者外周血血清，抽提HBVDNA，PCR擴增RT基因組后克隆、測序。實驗結(jié)果示慢性HBV感染過程中免疫清除期比免疫耐受期具有更寬的HBC變異譜系，肝硬化患者血清HBV RT區(qū)準(zhǔn)種復(fù)雜度最高，對抗病毒藥物的選擇有一定參考價值，值得進一步研究。

3.3 乙型病毒肝炎準(zhǔn)種及突變位點動態(tài)變化與HCC進展的關(guān)系 Mei等[29]篩選出研究對象為2010年確定的HCC高危人群，年齡30～65歲，血清乙型肝炎表面抗原陽性6個月以上，隨訪開始時經(jīng)超聲確認(rèn)無任何肝病，隨機選取1例最終發(fā)展為肝癌的患者(A)和1例非癌對照者(B)作為本研究的研究對象。采用巢式PCR方法，用兩套引物和兩輪PCR擴增HBV X基因區(qū)域。采用Reitman-Frankel法檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ELISA法檢測甲胎蛋白，評估肝損害程度和HCC進展情況。實驗結(jié)果顯示X蛋白的羧基功能域和氨基酸分別轉(zhuǎn)化為蛋氨酸和異亮氨酸(K130M和V131I)。以往的研究表明，這些突變可以減少HBeAg的合成，提高HBVDNA的復(fù)制水平，形成HBeAg陰性的慢性HBV感染，最終發(fā)展為HCC[30]。nt1630突變是與肝癌相關(guān)的另一個重要位點，位于SP1結(jié)合位點，以往的研究表明，核心啟動子的SP1結(jié)合位點對核心RNA和前核心RNA的轉(zhuǎn)錄起重要作用，另外，目前報道的肝癌相關(guān)突變有C1653T、T1753V、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1，G1386M、G1613A、A1727G、T1485、B1499、A1757/T1764/G1766和T1766/A1768可單獨或聯(lián)合作為HCC的預(yù)測因子[31-36]。因此，我們可以在肝細胞癌發(fā)生前的早期檢測到這些突變。然而，Mei等所發(fā)現(xiàn)的這些突變位點僅僅是A病例進展的原因，更多關(guān)于這些突變的作用和致病機制的證據(jù)還需要進一步的樣本和實驗來驗證和闡明。

4 總結(jié)與展望

近幾十年來，隨著新型抗病毒藥物的開發(fā)，慢性乙型肝炎的治療取得了顯著進展。然而，經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和耐藥性仍然是中國面臨的挑戰(zhàn)。許多治療問題仍不滿意或不清楚，需要進一步調(diào)查。準(zhǔn)種概念在抗病毒領(lǐng)域的應(yīng)用，以及對病毒機制的日益了解，隨著有希望的新藥物的研究，未來可能會實現(xiàn)慢性乙型肝炎的治愈。在臨床實踐中，如何利用多方位預(yù)測因子建立個體化治療策略還有待進一步的研究。