孫怡，張騰，呂波，李春，2

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生物化工研究所，北京 100081； 2 清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所，北京 100084）

引 言

在當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的大背景下，以可再生生物質(zhì)為原料的綠色生物制造得到迅速發(fā)展，涵蓋了能源、材料、藥品、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，旨在取代依賴石油資源的生產(chǎn)方式[1]。微生物細(xì)胞工廠是生物制造技術(shù)的主力軍[2]，已成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物[3]、生物燃料[4]和大宗化學(xué)品[5]等的合成,極大程度地解決了由于生產(chǎn)效率低或難以化學(xué)合成等原因而無法工業(yè)化生產(chǎn)的問題[6]。

對(duì)微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)各類化合物的合成及高產(chǎn)。利用代謝工程和發(fā)酵優(yōu)化等方法，國(guó)外的學(xué)者們?cè)诖竽c桿菌中實(shí)現(xiàn)順式-粘康酸的高產(chǎn)[7]，在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)大麻素類似物的合成[8]；而國(guó)內(nèi)的學(xué)者們也實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）的高產(chǎn)[9]和工程釀酒酵母中α-香樹脂醇的高產(chǎn)[10-11]。

在對(duì)微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行工程改造時(shí)，微生物細(xì)胞由于受到代謝負(fù)擔(dān)、化合物毒性和脅迫環(huán)境等不利影響，通常會(huì)導(dǎo)致效價(jià)和生產(chǎn)率降低[12]。此外，目前產(chǎn)生的代謝物主要使用液相色譜、氣相色譜及質(zhì)譜等分析方法來測(cè)量，這種方法耗時(shí)耗力，且產(chǎn)量較低[13]。面對(duì)這些棘手的問題，亟需提高微生物細(xì)胞工廠的精細(xì)調(diào)控，一方面要通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)“動(dòng)態(tài)”調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，維持旺盛的生長(zhǎng)，抵御環(huán)境波動(dòng)，而且要消除過量代謝物中間體和前體的產(chǎn)生，使中間體底物和輔因子向所需產(chǎn)物進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化；另一方面也要進(jìn)行高通量篩選，促進(jìn)化合物的高得率、高濃度和高生產(chǎn)率[13-15]。

近年來，在細(xì)胞中構(gòu)建的生物傳感器(biosensor)已成為監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞工廠的有力工具（圖1）。當(dāng)它與高通量篩選(high throughput screening,HTS)設(shè)備相結(jié)合，可以加速基因元件、代謝途徑和底盤細(xì)胞的優(yōu)化[16-18]；當(dāng)它與目標(biāo)化合物合成途徑相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)代謝途徑的反饋調(diào)節(jié)，以及化合物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)的耦合或解耦[19-20]。因此使用胞內(nèi)生物傳感器可以提高微生物細(xì)胞工廠的精細(xì)調(diào)控，解決微生物細(xì)胞工廠中目標(biāo)化合物生物合成的關(guān)鍵瓶頸問題[6,21-23]。

圖1 胞內(nèi)生物傳感器的設(shè)計(jì)與高效細(xì)胞工廠的構(gòu)建Fig.1 Design of intracellular biosensor and construction of high-efficiency cell factory

本文將從轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物傳感器進(jìn)行分類并闡明其工作原理，也將介紹胞內(nèi)生物傳感器提高微生物細(xì)胞工廠精細(xì)調(diào)控的應(yīng)用，及其設(shè)計(jì)和應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)。隨著胞內(nèi)生物傳感器功能的開發(fā)，其將對(duì)微生物細(xì)胞工廠的精細(xì)調(diào)控起到更重要的作用。

1 胞內(nèi)生物傳感器的分子基礎(chǔ)

胞內(nèi)生物傳感器(intracellular biosensor)指的是設(shè)計(jì)的細(xì)胞對(duì)某種物理、化學(xué)或生物信號(hào)進(jìn)行特異性感應(yīng)并能輸出可檢測(cè)信號(hào)的生物裝置。如圖2所示，胞內(nèi)生物傳感器具有兩個(gè)模塊，一是“傳感”模塊，用于檢測(cè)細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)的存在，即傳遞信號(hào)；二是“報(bào)告”模塊，將檢測(cè)到的信號(hào)轉(zhuǎn)換成輸出信號(hào)進(jìn)行報(bào)告。根據(jù)不同需求，可以選用光學(xué)信號(hào)，如熒光(gfp、deGFP、rfp、mScarlet)、比色(lacZ)和生物發(fā)光(lux、luc、NanoLuc)[24-25]，也可以選用電化學(xué)信號(hào)[26]進(jìn)行輸出報(bào)告。

圖2 胞內(nèi)生物傳感器的工作原理Fig.2 Working principle of intracellular biosensor

設(shè)計(jì)、構(gòu)建和優(yōu)化胞內(nèi)生物傳感器的關(guān)鍵元件，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)等，可以調(diào)節(jié)傳感器的靈敏度、檢測(cè)范圍和響應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性，提高其響應(yīng)效果[27-28]。

2 胞內(nèi)生物傳感器的分類及工作原理

將代謝物的濃度轉(zhuǎn)化為可測(cè)量輸出的生物傳感機(jī)制越來越多地用于細(xì)胞工程和合成生物學(xué)[20,29]。根據(jù)傳感模塊，即調(diào)節(jié)元件的不同，可大致將胞內(nèi)生物傳感器分為三大類，分別是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件作為胞內(nèi)生物傳感器、翻譯調(diào)節(jié)元件作為胞內(nèi)生物傳感器及蛋白質(zhì)作為胞內(nèi)生物傳感器（表1）。這三類生物傳感器既可以直接從天然元件中挖掘，也可以通過工程改造現(xiàn)有元件來獲得新的特異性或其他的特性。

表1 胞內(nèi)生物傳感器的分類及相關(guān)舉例Table 1 Classification of intracellular biosensors and related examples

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件作為胞內(nèi)生物傳感器

2.1.1 基于啟動(dòng)子的生物傳感器 在自然界中，細(xì)胞中具有進(jìn)化成能感應(yīng)應(yīng)激或代謝物特異性應(yīng)答的啟動(dòng)子。基于啟動(dòng)子的傳感器由不同的元件組成:傳感元件(啟動(dòng)子)和報(bào)告基因[圖3(a)]。識(shí)別合適的啟動(dòng)子通常是最關(guān)鍵的步驟。當(dāng)中間代謝物積累到毒性水平時(shí)，細(xì)胞將出現(xiàn)自然應(yīng)激反應(yīng)，啟動(dòng)子活性改變即為其中之一，通過這一現(xiàn)象能夠鑒定新的啟動(dòng)子。例如，通過全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析在大腸桿菌中鑒定了對(duì)法尼基焦磷酸(FPP)有響應(yīng)的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子被用來控制中間體的積累并提高嗎啡二烯的最終濃度，最終使嗎啡二烯的產(chǎn)量提高了兩倍，消除了對(duì)昂貴誘導(dǎo)劑的需求，減少醋酸鹽積累并改善大腸桿菌的生長(zhǎng)[30]。

除了對(duì)代謝物進(jìn)行應(yīng)答，啟動(dòng)子還可對(duì)酸[31]、溫度[50]、糖或糖苷類[32]以及細(xì)胞密度[33]進(jìn)行響應(yīng)。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者在黑曲霉中，通過轉(zhuǎn)錄分析鑒定了一個(gè)低pH誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgas，該啟動(dòng)子的強(qiáng)度與酸的類型和酸離子濃度無關(guān)，只與酸堿度有關(guān)，并在pH小于5 時(shí)能促進(jìn)衣康酸的表達(dá)，使其最終濃度為4.92 g/L[34]；在釀酒酵母中鑒定了兩個(gè)啟動(dòng)子PHSP12和PHSP26，其能響應(yīng)高溫和乙酸脅迫[35]。啟動(dòng)子是在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)基因高效、精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控的最關(guān)鍵元件之一，因而被廣泛使用。

2.1.2 基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器 轉(zhuǎn)錄因子可以根據(jù)特定的代謝物來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并被廣泛用于構(gòu)建胞內(nèi)生物傳感器[51]。如圖3(b)所示，當(dāng)被代謝物與轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活因子中的構(gòu)象變化使其能夠結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域中的特定DNA 序列，進(jìn)而增強(qiáng)報(bào)告基因(例如熒光蛋白基因、調(diào)節(jié)開關(guān)或選擇標(biāo)記)的表達(dá)；而代謝物與轉(zhuǎn)錄抑制因子特異性結(jié)合時(shí)[圖3(c)]，轉(zhuǎn)錄抑制因子中的構(gòu)象變化將其從啟動(dòng)子中釋放出來，并允許報(bào)告基因的表達(dá)。這類生物傳感器通過設(shè)計(jì)可以提供高靈敏度和寬響應(yīng)范圍，例如國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FapR的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析和重新設(shè)計(jì)，從而擴(kuò)大了釀酒酵母中丙二酰輔酶A 生物傳感器的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍[36]；基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器也可以將細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)相結(jié)合，利用建模和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比對(duì)淘汰掉假陽(yáng)性菌株，從而篩選出目標(biāo)化合物產(chǎn)量最優(yōu)菌株，例如在谷氨酸棒桿菌中通過在兩個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因pfkA 和hisD 上游整合基于Lrp 轉(zhuǎn)錄激活因子的生物傳感器，使谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)與支鏈氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的濃度相結(jié)合，在降低菌株生長(zhǎng)速度的同時(shí)大量生產(chǎn)L-纈氨酸[37]，在鈍齒棒桿菌中利用轉(zhuǎn)錄因子ArgR及報(bào)告基因SacB構(gòu)建響應(yīng)L-精氨酸的生物傳感器，使得高L-精氨酸產(chǎn)量的菌株可以在10%蔗糖篩選中存活，目前獲得L-精氨酸的最高產(chǎn)量為95.5 g/L[38]。

圖3 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件作為生物傳感器(a)基于啟動(dòng)子的生物傳感器;(b)基于轉(zhuǎn)錄激活因子的生物傳感器;(c)基于轉(zhuǎn)錄抑制因子的生物傳感器Fig.3 Biosensors based on transcription regulatory elements(a)biosensor based on promoter;(b)biosensor based on transcription activator;(c)biosensor based on transcription inhibitor

雖然挖掘內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄因子開發(fā)胞內(nèi)生物傳感器已經(jīng)取得成功，但是自然界中已被表征的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量有限，一種解決方法是采用基因組測(cè)序的策略來擴(kuò)展生物傳感器平臺(tái)庫(kù)，得到先前未表征的轉(zhuǎn)錄因子，例如通過挖掘嗜芳烴新鞘氨醇菌DSM 12444 基因組鑒定出對(duì)白藜蘆醇有特異響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，以此設(shè)計(jì)的生物傳感器不僅能檢測(cè)細(xì)胞中的白藜蘆醇，通過改造還能檢測(cè)同樣具有間苯二酚基團(tuán)的大麻二酚酸[39]；同樣通過基因組挖掘，利用共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出31 個(gè)MYB 家族的轉(zhuǎn)錄因子，揭示了其與靶結(jié)構(gòu)基因之間相對(duì)特定的調(diào)控關(guān)系[52]。需要注意的是，設(shè)計(jì)基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器，即便轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞內(nèi)源的，也通常需要進(jìn)行過表達(dá)[53]。另一種解決方法是利用蛋白質(zhì)工程等手段對(duì)已有的轉(zhuǎn)錄因子重新設(shè)計(jì)，改變其底物特異性，從而構(gòu)建出響應(yīng)更多化合物的胞內(nèi)生物傳感器[54]。

2.2 翻譯調(diào)節(jié)元件——“核糖體開關(guān)”生物傳感器

核糖體開關(guān)是mRNA 分子非翻譯區(qū)(UTR)中的調(diào)控元件，與小分子結(jié)合后，改變構(gòu)象，從而影響目標(biāo)蛋白的翻譯。在一個(gè)以“核糖體開關(guān)”為基礎(chǔ)的生物傳感器中，由RNA 適體結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，核糖體開關(guān)可以通過抑制抗終止子，通過隔離核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[55]，或通過mRNA 切割進(jìn)行后轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)控主要是通過與配體或代謝物直接結(jié)合的構(gòu)象變化來實(shí)現(xiàn)的(圖4)。

圖4 “核糖體開關(guān)”生物傳感器工作示意圖(a)通過抑制抗終止子停止轉(zhuǎn)錄;(b)通過隔離核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯進(jìn)行轉(zhuǎn)錄;(c)通過隔離核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯停止轉(zhuǎn)錄;(d)通過mRNA切割進(jìn)行后轉(zhuǎn)錄Fig.4 Schematic diagram of the“ribosomal switch”biosensors(a)stop transcription by inhibiting anti-terminator;(b)transcribing by isolating ribosome binding site translation;(c)stop transcription by isolating ribosome binding site translation;(d)post-transcription by mRNA cleavage

核糖體開關(guān)已被設(shè)計(jì)成對(duì)感興趣的目標(biāo)分子有反應(yīng)的胞內(nèi)生物傳感器[56-57]。例如，使用特征良好的茶堿適體作為傳感元件成功構(gòu)建響應(yīng)茶堿的生物傳感器[40]，而菠菜RNA 適體，在與3，5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮(DFHBI)[41]結(jié)合時(shí)能發(fā)出綠色熒光，被應(yīng)用于硫胺素5′-焦磷酸[42]和S-腺苷-同型半胱氨酸[43]生物傳感器的開發(fā)；有國(guó)外學(xué)者在大腸桿菌中設(shè)計(jì)了基于胍基的核糖體開關(guān)生物傳感器，胍是一種常見的離液劑，既是肥料又是爆炸性化合物的前體。該傳感器在胍處理后的4 min 內(nèi)就能激活細(xì)胞中的熒光，這種快速檢測(cè)活性的能力可維持1.6周[44]。目前，大多數(shù)基于RNA的生物傳感器已在細(xì)菌系統(tǒng)中報(bào)道，在酵母中發(fā)現(xiàn)的很少，因?yàn)樵诩?xì)菌中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)核糖開關(guān)在酵母中不起作用。

2.3 蛋白質(zhì)作為生物傳感器

2.3.1 “G 蛋白偶聯(lián)受體”生物傳感器 G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors, GPCRs) ,也稱7 個(gè)跨膜受體(7 transmembrane receptors，7TMRs)，是一類跨膜受體系統(tǒng)。該系統(tǒng)可將各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，使其成為細(xì)胞內(nèi)生物傳感器工程和開發(fā)有潛力的候選對(duì)象[58]。如圖5(a)所示，當(dāng)GPCRs 被細(xì)胞外信號(hào)激活時(shí)，GPCR 將與由α、β 和γ 亞基組成的G 蛋白偶聯(lián)，從α 亞基中分離出β 和γ 亞基的異二聚體，并激活下游效應(yīng)物。與其他基于蛋白質(zhì)的生物傳感器類似，通用蛋白質(zhì)識(shí)別系統(tǒng)的多功能性質(zhì)使其廣泛用于代謝物檢測(cè)。然而，基于GPCR 的生物傳感器通常僅限于細(xì)胞外傳感。有國(guó)外學(xué)者使用揮發(fā)性芳香化合物特有的氣味受體，構(gòu)建了一系列基于GPCR 的傳感器來檢測(cè)揮發(fā)性芳香化合物丁香酚、香豆素、二氫茉莉酮和苯乙酮[45]。

圖5 蛋白質(zhì)生物傳感器工作示意圖(a)基于G蛋白偶聯(lián)受體的生物傳感器;(b)雙組分系統(tǒng)生物傳感器;(c)F?rster共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器;(d)酶偶聯(lián)生物傳感器Fig.5 Schematic diagram of protein biosensors work(a)G protein-coupled receptor-based biosensor;(b)two-component system biosensor;(c)F?rster resonance energy transfer biosensor;(d)enzyme-coupled biosensor

2.3.2 雙組分系統(tǒng)生物傳感器 雙組分系統(tǒng)(twocomponent system,TCS)生物傳感器允許微生物感知環(huán)境變化或瞄準(zhǔn)代謝物。先前的研究表明，雙組分系統(tǒng)生物傳感器可被設(shè)計(jì)和工程化為不同應(yīng)用的胞內(nèi)生物傳感器[59]。典型的TCS 系統(tǒng)包括組氨酸激酶(histidine kinase, HK)和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(response regulator,RR)[圖5(b)]。環(huán)境變化或目標(biāo)代謝物的存在誘導(dǎo)HK 的自磷酸化，隨后磷酰基轉(zhuǎn)移到RR，磷酸化的RR 進(jìn)一步調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)。HK 是一種跨膜蛋白，HK的C端激酶結(jié)構(gòu)域通常位于胞質(zhì)溶膠中，其用于刺激感知的N 端結(jié)構(gòu)域可定位于胞質(zhì)外區(qū)室(周質(zhì)、內(nèi)膜或外膜，甚至細(xì)胞外空間)。氮末端傳感器結(jié)構(gòu)域的定位使TCS傳感器能夠感測(cè)不同細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外空間中的代謝物。先前的研究已經(jīng)表明，TCS 的模塊化設(shè)計(jì)可用于產(chǎn)生具有新效應(yīng)分子特異性的傳感器激酶，并將信息轉(zhuǎn)導(dǎo)至基因表達(dá)水平[60]。有國(guó)外學(xué)者研發(fā)了一個(gè)響應(yīng)蘋果酸的TCS 生物傳感器，通過將來自枯草芽孢桿菌的MalK傳感器結(jié)構(gòu)域融合到來自大腸桿菌的EnvZ 激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)建嵌合體，該傳感器可以通過控制ompC 啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而對(duì)外部蘋果酸的積累產(chǎn)生響應(yīng)[46]。

2.3.3 “F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移”生物傳感器 基于F?rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的生物傳感器也用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)代謝物。通常，F(xiàn)RET 傳感器包含一個(gè)內(nèi)部代謝物結(jié)合蛋白(metabolite binding protein ,MBP)，兩側(cè)是一對(duì)供體和受體熒光蛋白(fluorescent proteins, FPs)[圖5(c)]。當(dāng)MBP 結(jié)合目標(biāo)化合物時(shí)，有一個(gè)構(gòu)象變化來改變供體和受體FPs的分子內(nèi)距離，其中來自供體FP 的發(fā)射激發(fā)受體FP，給出代謝物濃度的可測(cè)量輻射指數(shù)。青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein , CFP)和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein , YFP)通常用作供體和受體熒光蛋白對(duì)。與基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器相比，F(xiàn)RET傳感器通過避免基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器在誘導(dǎo)基因表達(dá)和信號(hào)之間的時(shí)滯，具有更快的信號(hào)響應(yīng)。

多年來，F(xiàn)RET 傳感器已被開發(fā)用于檢測(cè)廣泛的代謝物，如糖[61]、氨基酸[62]、丙酮酸鹽[63]、乳酸鹽[64]、離子[65]以及氧化還原狀態(tài)[66]。例如，已發(fā)現(xiàn)變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子LghR 能對(duì)L-2-羥基戊二酸（L-2-HG）進(jìn)行特異性響應(yīng)，而L-2-HG 在各種生理過程例如碳饑餓反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和低氧適應(yīng)中起重要的作用，因此構(gòu)建感應(yīng)L-2-HG的FRET傳感器，進(jìn)而可以監(jiān)測(cè)不同生物樣本中L-2-HG 的濃度[47]。然而，F(xiàn)RET 傳感器由于其相對(duì)較低的絕對(duì)信號(hào)而很少用于篩選[67]。

2.3.4 酶偶聯(lián)生物傳感器 另一種基于蛋白質(zhì)的胞內(nèi)生物傳感器依賴于酶偶聯(lián)反應(yīng)。這種生物傳感器利用酶催化反應(yīng)，可以將目標(biāo)代謝物轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的生色和熒光物質(zhì)[圖5(d)]。這種傳感器的開發(fā)需要相關(guān)反應(yīng)的先驗(yàn)知識(shí)。在某些情況下，所需的反應(yīng)可以一步完成。例如，l-3,4-二羥基苯丙氨酸(l-DOPA)的酶偶聯(lián)生物傳感器是通過在DOPA 雙加氧酶的幫助下將l-DOPA轉(zhuǎn)化為黃色熒光色素β-黃嘌呤而開發(fā)的[48]。在其他情況下，需要一連串的反應(yīng)才能形成可檢測(cè)的分子。例如，木糖或乳酸可以通過酶偶聯(lián)生物傳感器來檢測(cè)。結(jié)果表明，吡喃糖氧化酶和乳酸氧化酶會(huì)分別氧化木糖和乳酸，同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化氫(H2O2)。H2O2副產(chǎn)物隨后被辣根過氧化物酶氧化，導(dǎo)致產(chǎn)生易于檢測(cè)的熒光化合物間苯二酚[49]。為了創(chuàng)建酶偶聯(lián)生物傳感器，也有幾種情況結(jié)合使用酶和化學(xué)反應(yīng)。最近，通過結(jié)合胞苷脫氨酶(CDA)和靛酚法開發(fā)了胞苷的酶測(cè)定法[68]。

3 胞內(nèi)生物傳感器對(duì)微生物細(xì)胞工廠的精細(xì)調(diào)控

現(xiàn)如今，谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌、米根霉、乳酸桿菌等微生物已被廣泛用作生產(chǎn)有價(jià)值化合物的細(xì)胞工廠。盡管已經(jīng)對(duì)各種微生物進(jìn)行了評(píng)估，能夠進(jìn)行高值化合物的可持續(xù)生物轉(zhuǎn)化，但使用細(xì)胞工廠的目的應(yīng)該是建立廉價(jià)和高產(chǎn)率的生物過程，并且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無害。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，高效細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)需要在宿主生物體中進(jìn)行合成途徑的監(jiān)測(cè)與調(diào)節(jié)，以優(yōu)化目標(biāo)化合物的生產(chǎn)率。

生物傳感器是一種非常有利的工具，如表2 所示，當(dāng)其與可讀輸出(如熒光)或抗生素相結(jié)合，開發(fā)成高通量篩選平臺(tái)，這種方法通常用于選擇高產(chǎn)遺傳變異體或確定導(dǎo)致產(chǎn)品高濃度的工藝條件[81]。而當(dāng)應(yīng)用于動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝途徑時(shí)，生物傳感器能精準(zhǔn)探測(cè)細(xì)胞的代謝狀態(tài)并根據(jù)情況將代謝物的產(chǎn)生與細(xì)胞生長(zhǎng)解耦或耦合[19-20]，從而補(bǔ)償工程化途徑的代謝活性，并提高工程化細(xì)胞工廠的整體生產(chǎn)率和適應(yīng)性[82]。

表2 胞內(nèi)生物傳感器應(yīng)用于微生物細(xì)胞工廠的經(jīng)典案例Table 2 Classic cases of intracellular biosensors applied to microbial cell factories

3.1 胞內(nèi)生物傳感器應(yīng)用于細(xì)胞工廠的高通量篩選

微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)化合物的進(jìn)化工程需要有效的篩選方法來測(cè)試大量的突變體庫(kù)。當(dāng)通過改變顏色、熒光、大小、更高的細(xì)胞密度或其他容易觀察到的特征可以進(jìn)行酶分析或菌株篩選時(shí)，可以使用各種技術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting ,FACS)、比色分析、分光光度計(jì)或微流體分選裝置容易地獲得所需的突變體。然而，這種易于篩選的特性對(duì)于許多工程酶和菌株來說無法使用。在這種情況下，進(jìn)化工程中的一個(gè)重要瓶頸是缺乏合適的篩選方法來從一群菌株或酶中選擇改良的變體。因此，具有所需特性的酶或菌株的選擇通常受限于緩慢和低通量技術(shù)的使用，例如液相色譜、氣相色譜或質(zhì)譜[83]。

能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞代謝的生物傳感器有望應(yīng)用于高通量篩選。胞內(nèi)生物傳感器與代謝物相互作用產(chǎn)生可讀的輸出，可與高通量篩選裝置結(jié)合，以快速篩選高產(chǎn)菌株[84]。最常見的是生物傳感器與流式細(xì)胞儀(FACS)，通過熒光的強(qiáng)弱來高效快速地篩選突變株，目前已經(jīng)開發(fā)了各種類型的基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器，能夠篩選代謝物，包括內(nèi)酰胺[69]、丙二酰輔酶A[20]、木糖[70]和NADPH[54]等；而核糖體開關(guān)生物傳感器已在微生物細(xì)胞工廠中應(yīng)用于乙酰神經(jīng)氨酸[72]和新霉素[73]等的篩選。除了常用的FACS之外，近期Liu 等[74]利用RNA 具有折疊成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的靈活性，構(gòu)建了基于色氨酸特異性適體的生物傳感器，結(jié)合熒光激活液滴分選系統(tǒng)，建立了色氨酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選平臺(tái),最終成功篩選到色氨酸產(chǎn)量比原始菌株高165.9%的突變株。生物傳感器也可與抗生素抗性基因偶聯(lián)起到篩選優(yōu)良菌株的功能，有國(guó)外學(xué)者利用早先開發(fā)的3-羥基丙酸轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合四環(huán)素抗性對(duì)菌株進(jìn)行基于抗性壓力的定向進(jìn)化，馴化出的菌株3-羥基丙酸產(chǎn)量達(dá)到7.7 g/L[71]；亦有國(guó)外學(xué)者在釀酒酵母中將自切割核酶glmS整合到胞嘧啶脫氨酶FCY1的3′-非翻譯區(qū)，以構(gòu)建用于進(jìn)化工程的自殺核糖體開關(guān)生物傳感器，添加氟胞嘧啶阻礙了含有自殺核糖開關(guān)的菌株的生長(zhǎng)，但隨著細(xì)胞內(nèi)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)水平的增加而恢復(fù)生長(zhǎng)，從而篩選出高產(chǎn)菌株[75]。

將胞內(nèi)生物傳感器應(yīng)用到高通量篩選時(shí)，有很多關(guān)鍵因素需要考慮，包括檢測(cè)通量的大小[85]、傳感器的特性、篩選設(shè)備的要求、通過篩選獲得假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)以及傳感器的輸入和輸出的動(dòng)態(tài)變化，在構(gòu)建應(yīng)用于高通量篩選的胞內(nèi)生物傳感器時(shí)，應(yīng)權(quán)衡分析所有的關(guān)鍵因素。

3.2 胞內(nèi)生物傳感器“動(dòng)態(tài)”調(diào)控代謝平衡

在工程設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞工廠的過程中，常遇到的一類棘手的問題就是由代謝失衡引起的干擾，目前的一種解決方法是利用生物傳感器進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，生物傳感器根據(jù)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)或細(xì)胞外環(huán)境狀態(tài)自主控制代謝流量，以避免代謝不均衡或減少有毒代謝物的數(shù)量[86-87]，使代謝流向更有力的方向，提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。

3.2.1 細(xì)胞工廠產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)解耦 在微生物細(xì)胞工廠中，一些生物合成途徑與細(xì)胞生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)。傳統(tǒng)上，可以通過阻斷競(jìng)爭(zhēng)途徑來解決，但它可能會(huì)妨礙細(xì)胞的生存能力，從而降低生產(chǎn)率[88]。

另一種有效的解決方法是利用生物傳感器的自主動(dòng)態(tài)調(diào)控，解耦細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)以避免化合物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)之間競(jìng)爭(zhēng)[89][圖6(a)]。應(yīng)用對(duì)葡萄糖濃度作出反應(yīng)的“營(yíng)養(yǎng)”傳感器延遲了香草酸的合成，從而使大腸桿菌中的細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)解耦。代謝壓力測(cè)試顯示，這種營(yíng)養(yǎng)傳感模塊的引入將代謝負(fù)擔(dān)降低至原來的1/2.4，并在生物轉(zhuǎn)化為香草酸的過程中實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)勁的增長(zhǎng)率[76]；將肌醇(myoinositol,MI)生物傳感器和群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)相結(jié)合，這種分層動(dòng)態(tài)途徑控制策略被用于D-葡萄糖二酸的生物合成。這一策略同時(shí)平衡了關(guān)鍵中間體肌醇的生產(chǎn)和消耗速率以及解耦的細(xì)胞生長(zhǎng)和D-葡萄糖二酸的生產(chǎn)，以避免與必需的糖酵解競(jìng)爭(zhēng)，使D-葡萄糖二酸最終濃度增加了五倍，達(dá)到2 g/L[21]；通過將植物激素細(xì)胞分裂素系統(tǒng)與酵母內(nèi)源Ypd1-Skn7 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相整合而開發(fā)出群體感應(yīng)，在釀酒酵母中構(gòu)建了一個(gè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，并使用群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素合成以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解的動(dòng)態(tài)控制，將這一策略應(yīng)用到α-法尼烯的生產(chǎn)中，使其效價(jià)提高了80%[77]；將群體感應(yīng)生物傳感器應(yīng)用到酪醇生產(chǎn)菌株和紅景天苷生產(chǎn)菌株的共培養(yǎng)中，理論建模分析與具體實(shí)驗(yàn)研究并重，不僅能自動(dòng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)，使菌株生長(zhǎng)平衡，還提高了代謝產(chǎn)物酪醇和紅景天苷的產(chǎn)量[78]。雖然胞內(nèi)生物傳感器將產(chǎn)物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)分開這個(gè)策略可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間開啟或關(guān)閉基因表達(dá)，不需要借助外界信號(hào)就可以實(shí)現(xiàn)自身代謝途徑的控制，但系統(tǒng)中的一些問題仍需要考慮，例如基因一旦開啟表達(dá)是不可逆的，并且為了保證胞內(nèi)生物傳感器的真實(shí)可用性還需要對(duì)傳感器內(nèi)關(guān)鍵元件的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行大量篩選和匹配，或者插入幾個(gè)基因表達(dá)盒來制造恰當(dāng)?shù)臅r(shí)滯以實(shí)現(xiàn)生物合成途徑的適時(shí)開啟。

3.2.2 細(xì)胞工廠產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)耦合 一般有效的高產(chǎn)量生產(chǎn)通常會(huì)引入代謝負(fù)擔(dān)，該負(fù)擔(dān)會(huì)選擇大型發(fā)酵中非生產(chǎn)性細(xì)胞亞群。這種情況下應(yīng)用的另一種調(diào)節(jié)代謝平衡的策略是將目標(biāo)化合物的生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)相結(jié)合，而不是將細(xì)胞生長(zhǎng)與生產(chǎn)解耦。通過操縱和重頭設(shè)計(jì)微生物代謝，使得代謝物的合成成為細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，從而實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)的表型，還增加了細(xì)胞的魯棒性[90]。然而，建立生長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)的表型通常需要有一種或多種細(xì)胞生長(zhǎng)必需的成分從該途徑產(chǎn)生，這限制了該方法的普遍性。一種更普遍的方法是“產(chǎn)物成癮”策略，利用胞內(nèi)生物傳感器將產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)耦合，如圖6(b)所示，細(xì)胞工廠的產(chǎn)物被生物傳感器特異性響應(yīng)，傳感器中的報(bào)告基因由細(xì)胞生長(zhǎng)必需基因替代，只有不停地合成該產(chǎn)物，生長(zhǎng)必需基因才能持續(xù)發(fā)揮作用，細(xì)胞才能得以存活。有國(guó)外學(xué)者在大腸桿菌中通過仔細(xì)地將必需基因folP 和glmM 置于只對(duì)甲羥戊酸有反應(yīng)的生物傳感器的控制之下，甲羥戊酸存在的信號(hào)與無條件必需基因的表達(dá)相聯(lián)系，使大腸桿菌細(xì)胞沉迷于甲羥戊酸的生物合成工程中，并使一個(gè)穩(wěn)定的甲羥戊酸高產(chǎn)菌株能夠保持超過95 代的性能[79]。胞內(nèi)生物傳感器使產(chǎn)物合成與生長(zhǎng)耦合這一策略還可以關(guān)注單個(gè)細(xì)胞之間的差異，如國(guó)內(nèi)學(xué)者開發(fā)了一種生長(zhǎng)耦合柚皮素-香豆酸-丙二酰輔酶A 平衡的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(dynamic regulation network,DRN)，一方面利用已報(bào)道的柚皮素（基于轉(zhuǎn)錄因子FdeR）生物傳感器，通過偶聯(lián)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)放大向柚皮素合成的代謝通量，另一方面引入香豆酸（基于PadR）生物傳感器來動(dòng)態(tài)響應(yīng)香豆酸，這個(gè)模塊用于增強(qiáng)丙二酰輔酶A的合成，并抑制乙酰輔酶A 流向TCA 循環(huán)，這種多層次的DRN 可以根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞譜動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)代謝通量，最終菌株發(fā)酵優(yōu)化后柚皮素產(chǎn)量提高8.7 倍，菌株生長(zhǎng)改善20%[80]。

圖6 生物傳感“動(dòng)態(tài)”調(diào)控代謝平衡示意圖Fig.6 Schematic diagram of biosensing“dynamic”regulation of metabolic balance

到目前為止，在產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)耦合這一策略中利用胞內(nèi)生物傳感器構(gòu)建的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)還需解決兩個(gè)問題，一是響應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，在設(shè)計(jì)動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)時(shí)，胞內(nèi)生物傳感器的響應(yīng)需要足夠靈敏，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝通路的有效調(diào)控，縮短發(fā)酵時(shí)間；其次是穩(wěn)定性的優(yōu)化，在實(shí)際應(yīng)用中，調(diào)控系統(tǒng)必須足夠穩(wěn)定，才可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)標(biāo)準(zhǔn)化的操作。

4 胞內(nèi)生物傳感器設(shè)計(jì)面臨的挑戰(zhàn)

設(shè)計(jì)細(xì)胞內(nèi)生物傳感器不僅需要對(duì)基因修飾進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的試錯(cuò)迭代，還需要對(duì)修飾的微生物宿主進(jìn)行表征[91]。盡管生物傳感器的構(gòu)建和評(píng)估已有顯著進(jìn)展，但是在設(shè)計(jì)胞內(nèi)生物傳感器方面仍然存在一系列的挑戰(zhàn)。

基于轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的胞內(nèi)生物傳感器在高通量篩選和動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝平衡中被廣泛使用[92]。但其中主要存在兩個(gè)問題，一是天然的轉(zhuǎn)錄因子的配體特異性較低，構(gòu)建出的生物傳感器靈敏度低，響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍窄，這需要利用蛋白質(zhì)工程來拓寬或者改變配體特異性[93]；二是不可預(yù)測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍，而生物傳感器系統(tǒng)里的基因要表達(dá)必須有適當(dāng)?shù)姆g強(qiáng)度，這是由核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)控制的，所以可以設(shè)計(jì)一個(gè)基于跨RBS(cRBS)大型數(shù)據(jù)集深度學(xué)習(xí)的平臺(tái)，來預(yù)測(cè)調(diào)整生物傳感器的動(dòng)態(tài)范圍[94]。當(dāng)在微生物中設(shè)計(jì)“核糖體開關(guān)”生物傳感器時(shí)，盡管具有高度的配體特異性可以使轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以更簡(jiǎn)單的方式驅(qū)動(dòng)，但由于對(duì)核糖體開關(guān)結(jié)構(gòu)切換機(jī)制的理解有限，其合理設(shè)計(jì)仍處于發(fā)展階段[95-96]，至今還有一些難解決的問題，例如關(guān)鍵RNA 元件數(shù)量有限、生物傳感器的功能通常受限于動(dòng)態(tài)響應(yīng)和操作范圍等，這需要新的策略來支持核糖體開關(guān)的構(gòu)建，可以將高通量測(cè)序和計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)相結(jié)合，搭建一個(gè)評(píng)估序列-結(jié)構(gòu)-功能的平臺(tái)，從而獲得大量的數(shù)據(jù)，便于分析RNA 序列和功能之間的關(guān)系，以提高構(gòu)建有功能的核糖體開關(guān)生物傳感器的能力[97]。而基于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的胞內(nèi)生物傳感器通常是基于天然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的，面臨著蛋白質(zhì)數(shù)量有限的窘境，目前常見的解決方法是利用專業(yè)軟件及計(jì)算機(jī)學(xué)習(xí)來重頭設(shè)計(jì)，不過這仍具有挑戰(zhàn)性[98-99]。從關(guān)鍵元件的挖掘到胞內(nèi)生物傳感器的構(gòu)建，整個(gè)過程和計(jì)算機(jī)的深度學(xué)習(xí)相結(jié)合是一種趨勢(shì)，利用前沿學(xué)科交叉的策略來解決問題更加有效。

除此之外，胞內(nèi)生物傳感器在不同微生物細(xì)胞工廠中由于過程和條件的不同，其工作效率也不盡相同。以響應(yīng)丙二酰輔酶A 的胞內(nèi)生物傳感器為例，同樣是利用轉(zhuǎn)錄因子FapR 構(gòu)建生物傳感器，但因?yàn)槭谴竽c桿菌和釀酒酵母這兩種不同的宿主細(xì)胞，胞內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的啟動(dòng)子不同，培養(yǎng)兩種宿主細(xì)胞的條件也相應(yīng)變化，導(dǎo)致生物傳感器的工作效率有所不同，其最終的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍亦不同[100-102]。所以一個(gè)有效的胞內(nèi)生物傳感器需要結(jié)合具體的生化過程進(jìn)行設(shè)計(jì)，首先要考慮生物傳感器的設(shè)計(jì)目的，是為高通量篩選還是為動(dòng)態(tài)調(diào)控，要根據(jù)不同的目的有側(cè)重性地設(shè)計(jì)和優(yōu)化胞內(nèi)生物傳感器；其次要考慮微生物細(xì)胞宿主的種類，其會(huì)決定傳感器的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的容易程度及傳感器在其中的復(fù)制和維護(hù)；最后為了獲得高檢測(cè)限和寬動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍，需要傳感模塊與報(bào)告模塊表達(dá)的適當(dāng)平衡，即要考慮到傳感器兩個(gè)模塊的質(zhì)?？截悢?shù)、傳感器關(guān)鍵元件的數(shù)量和結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度等因素。

5 結(jié)論與展望

在過去的十幾年中，用于化合物合成的胞內(nèi)生物傳感器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用取得了重大進(jìn)展。這些生物傳感器成為篩選酶和代謝物的有利工具，可以加快工程化設(shè)計(jì)微生物的進(jìn)程。不過胞內(nèi)生物傳感器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用依舊存在一些挑戰(zhàn)，要持續(xù)不斷地努力來改進(jìn)和提高生物傳感器的設(shè)計(jì)方法，構(gòu)建具有所需功能（動(dòng)態(tài)范圍、靈敏度和底物特異性）的生物傳感器，其中為了匹配相鄰模塊的輸出和輸入，良好控制胞內(nèi)生物傳感器的動(dòng)態(tài)范圍變得尤為重要，這可以通過蛋白質(zhì)工程等方法開發(fā)更標(biāo)準(zhǔn)化的傳感器元件來實(shí)現(xiàn)，從而促進(jìn)生物傳感器的發(fā)展。展望未來，預(yù)計(jì)在微生物細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)中會(huì)越來越多地采用胞內(nèi)生物傳感器來優(yōu)化菌株開發(fā)和合成途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，胞內(nèi)生物傳感器將為提高微生物細(xì)胞工廠代謝精細(xì)調(diào)控和目標(biāo)化合物合成能力發(fā)揮重要的作用。