張家翔 韓佃剛 楊云慶 周思佳 楊妮 信吉閣

摘要 CRISPR/Cas9是一種高效率、簡單操作、低成本的基因編輯工具，近年來廣泛應用于動物、植物和微生物基因敲除研究，為深層次地應用于醫(yī)學研究奠定了基礎。概述CRISPR/Cas9技術在動物、植物和微生物的基因敲除中的研究進展，并對其深入研究進行展望。

關鍵詞 CRISPR/Cas9;基因敲除;基因編輯;應用

中圖分類號 Q 78? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0016-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.004

CRISPR/Cas9 Technology and Research Progress in Gene Knockout

ZHANG Jia-xiang1，HAN Dian-gang2，YANG Yun-qing2 et al

（1.College of Veterinary Medicine，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201;2.Technology Center of Kunming Customs，Kunming，Yunnan 650200）

Abstract CRISPR / Cas9? is a gene editing technology with high editing efficiency，simple operation and low cost.In recent years，this technology has been widely used in the study of gene knockout in animals，plants and microorganisms，which has laid a foundation for medical research in the future.This paper summarized the research progress of CRISPR/Cas9 technology in gene knockout in animals，plants and microorganisms，and forecasted its in-depth research.

Key words CRISPR/Cas9;Gene knockout;Gene editing;Application

基金項目 國家自然科學基金項目（31960658，31360532）;云南省科技計劃項目（2013FB041）;國家質檢總局科技計劃項目（2012IK025）。

作者簡介 張家翔（1996—），男，重慶人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生。通信作者，副教授，博士，從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學研究。

收稿日期 2021-04-21

近年來，CRISPR/Cas9（成簇有規(guī)律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9）技術因在生物技術領域的主要應用而被廣泛認可。CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[1]。CRISPR的序列最早是由日本分子生物學家石野良純（Yoshizumi Ishino）于1987年在大腸桿菌中偶然發(fā)現的，2003年西班牙微生物學家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）進一步發(fā)現CRISPR中獨特的非重復的序列與各種病毒的遺傳密碼相匹配。隨著研究的不斷深入，研究人員確定了CRISPR是一種源自細菌的適應性免疫系統(tǒng)[2-3]。

CRISPR/Cas9技術被認為是第三代基因編輯技術[4]，其是一種非常有目標性的工具，幾乎可以靶向任何基因，且操作較為簡便、敲除效率較高[5-7]。CRISPR/Cas技術改變了基因組學、基因編輯、基因治療和基因組成像等領域，同時這一技術的廣泛應用為理解和操縱遺傳或表觀遺傳元素拓展了巨大的范圍。該技術在體系完成對靶標基因的遺傳編輯后，可在后代配子形成過程中隨著染色體的分離而去除，在編輯后代中無轉基因的痕跡，無需引用外源基因，因此生物安全性高[8]。CRISPR/Cas9技術是一種流行的工具，目前已經廣泛用于動物、植物以及微生物基因組編輯[9]。

1 原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是以crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基的互補配對，與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成tracrRNA/crRNA復合物，然后通過這個過程所形成的復合物來引導核酸酶Cas9蛋白，再與crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人為設計這2種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA（single-guide RNA），引導Cas9對DNA的定點切割[10]，工作原理[11]見圖1。

2 應用

2.1 在動物上的應用

CRISPR/Cas9基因組編輯技術目前正在改變廣泛動物模型中的遺傳學研究。CRISPR/Cas9技術在動物上的應用主要是利用基因敲除技術和胚胎干細胞技術制備的某一特定位點基因缺失的動物，從而得到一些動物模型，能夠更好地獲得一些信息以及得到實際生產應用[12]。

現已經利用CRISPR/Cas9技術誘導豬胎兒成纖維細胞 （pig fetal fibroblasts，PFF）發(fā)生非同源性末端接合（non-homologous end joining，NHEJ），通過體細胞核移植 （somatic cell nuclear transfer，SCNT） 技術和胚胎移植 （embryo transfer，ET）技術獲得了MSTN雙等位基因敲除豬（knockout，KO）[13]。張婷婷等[14]利用電轉染法把CRISPR/Cas9、sgRNA和目的載體共同轉入巴馬豬PFF，篩選單細胞克隆，合成了hHBB突變體，共制備出15株有hHBB突變體定點敲入細胞系。許金蔓等[15]根據豬的PFKM基因序列結構特點，設計出了sgRNA序列，同時構建CRISPR/Cas9基因敲除質粒，試驗結果表明，在已經轉染了的CRISPR/Cas9基因敲除質粒篩選到的單細胞克隆中，有2株細胞PFKM基因序列發(fā)生了基因突變，其中1個克隆為堿基插入，另1個為堿基插入、替換及缺失，再通過qRT-PCR定量檢測后，篩選到1株細胞PFKM mRNA表達量下降89.41%，差異極顯著。曹興林等[16]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建敲除了IFN-β1編碼序列的MDCK單細胞克隆。該克隆生長旺盛、病毒增殖能力維持較高水平，為禽流感病毒抗原的規(guī)模增殖及相關機理研究奠定了試驗基礎。李忠慧[17]運用CRISPR/Cas9對羊毛生長性狀相關的功能基因進行修飾，以獲得基因編輯綿羊。

隨著技術不斷更新，CRISPR/Cas9基因敲除技術日趨成熟，利用該技術已經成功改良了一些家畜的產肉產毛量，改善了家畜的健康狀況等，為之后更多的動物領域研究提供了便利。

2.2 在植物上的應用

傳統(tǒng)的改良作物性狀的育種方法是利用一系列的回交和選擇，將一個有益性狀導入優(yōu)良種質中，是比較耗費時間和資源的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種先進的用于植物基因功能研究和作物改良的通用工具，近年來該系統(tǒng)在植物上的研究也越來越廣泛，在主要糧食及經濟作物的精準育種方面發(fā)揮了重要作用[18]。

張宗飛等[19]、李孟珠等[20]都將CRISPR/Cas9技術運用在了水稻上，張宗飛團隊成功創(chuàng)建了2個已鑒定的水稻OsFRK家族基因的敲除突變體，獲得28株OsFRK1的T0代轉基因植株[19];李孟珠團隊則是構建了水稻的OsSUT4缺失變體，通過進一步分析OsSUT4在水稻蔗糖源端裝載以及籽粒庫端卸載等生理過程發(fā)揮重要作用[20]。李星坤等[21]以擬南芥糖基轉移酶同工酶基因UGT84A1和UGT84A2為靶向基因，構建了CRISPR/Cas9雙突變體表達載體，并將其轉化到農桿菌浸染擬南芥，同時定向敲除靶向基因成功構建了UGT84A1/UGT84A2雙突變體。李鵬[22]也利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功完成對擬南芥AtILR3編輯靶位點的篩選及載體構建。Badhan Sapna等[23]首次在鷹嘴豆原生質體中利用CRISPR/Cas9進行DNA基因編輯抗旱相關基因，成功培育出抗旱植株。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一個快速、經濟、精確的作物改良工具，不涉及相關倫理問題，同時在植物上表現的脫靶效應較小，因此，該技術在植物上的應用越來越廣泛，也為后續(xù)研究提供了便利。

2.3 在微生物上的應用

雖然細菌的CRISPR/CAS系統(tǒng)已經衍生出多種技術，但遺憾的是，這些技術在細菌中的應用還遠不如在真核生物中的應用廣泛，也偶見報道[24]。大多數CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在微生物上的應用，主要是獲得基因缺失菌株以及構建系統(tǒng)，為進一步的研究提供技術基礎和理論依據[25]。

有學者在研究中分別將CRISPR/Cas9基因編輯技術運用在了酵母菌上。劉磊等[26]利用CRISPR/Cas9敲除gpd2，構建了適用于釀酒酵母的基因敲除系統(tǒng);李夢琦等[27]成功地在Lager酵母中構建了基因敲除系統(tǒng);胡婧等[28]采用整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將sgRNA克隆到pV1093質粒中，通過醋酸鋰法轉化白念珠菌野生型菌株SN148和PCR驗證基因型，成功構建了MTQ2純合子缺失菌株;Huang等[29]在杜邦嗜熱菌中開發(fā)了嗜溫和嗜熱2個CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并表征了熱內酯生物合成和真菌適應中的關鍵基因功能。

基因操縱微生物的能力對于理解微生物的生物學和新陳代謝至關重要。該技術的出現為各種微生物的基因功能、代謝調控等研究提供了簡單、快速和高效的方法。隨著日后CRISPR/Cas9技術的改進和完善，其在微生物上的應用也將越來越廣泛。

3 小結與展望

以CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯是一種高效、有潛力的技術，其可以替代傳統(tǒng)的基因組編輯方法，同時由于這項技術有著快速、靈活和高效的特性，使其能夠廣泛應用于植物、動物以及微生物等許多領域。近年來新興起了鋅指核酸酶技術（ZFNs）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術（TALENs）及CRISPR/Cas9技術等多種基因高效靶向修飾和調控技術。CRISPR/Cas9相比于ZFNs和TALENs，其最顯著的優(yōu)勢是特異性更高，但該特性取決于sgRNA的識別序列[30]。自2012年首次證明了CRISPR/Cas9可以在體外進行DNA切割試驗以來，CRISPR技術逐漸在基因編輯研究中獲得了迅速的發(fā)展，除了應用于基因編輯領域之外，它在基因表達調控、基因成像、基因分析等方面也展現出了巨大的應用潛力[31]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前已經為基因組編輯提供了前所未有的可能性，但是，也存在著一些局限性，包括實現高效的一步多基因組目標，以節(jié)省成本、時間，并確保高質量。同時CRISPR/Cas9基因編輯技術雖然存在著脫靶、工具質粒不穩(wěn)定、Cas9蛋白毒性作用等問題，但因有著簡單、高效等優(yōu)勢，使其在目前廣泛應用于多個領域（微生物、動物、植物等），尤其在哺乳動物和人類的多種疾病治療、藥物以及作物培育研究等方面的應用越來越成熟[32]。同時對CRISPR/Cas9技術潛在應用的進一步研究將有助于克服這些難關，相信隨著CRISPR系統(tǒng)的不斷改進，該技術不僅能為研究人員提供基因的操縱和改變及功能研究，促進研究人員對疾病分子基礎的認識和新的靶向治療方法的開發(fā)，而且在今后的生物學、農學和醫(yī)學領域將具有更為廣闊的應用前景。

參考文獻

[1] 劉成，司振書，郭晶，等.CRISPR/Cas9基因編輯技術在禽病毒病研究中的應用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2021，43（10）：1124-1129.

[2] 汪銘.CRISPR/Cas9技術：基因魔剪[J].科學通報，2020，65（36）：4168-4170.

[3] 蔣艷紅，吳宇軒.CRISPR/Cas9系統(tǒng)：開啟基因編輯新時代——2020年諾貝爾化學獎簡介[J].自然雜志，2020，42（6）：456-462.

[4] 常雯茹，段利芳，楊樂，等.偽狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除細胞系的復制規(guī)律研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2021，48（1）：83-92.

[5] 朱奕騁.CRISPR/Cas9技術的研究進展及其在肺癌研究中的應用[J].科技傳播，2020，12（14）：172-174.

[6] TANG Y D，GUO J C，WANG T Y，et al.CRISPR/Cas9-mediated 2-sgRNA cleavage facilitates pseudorabies virus editing[J].FASEB journal，2018，32（8）：4293-4301.

[7]? ALTAVILLA D，SAITTA A，SQUADRITO G，et al.Evidence for a role of nuclear factor-κB in acute hypovolemic hemorrhagic shock[J].Surgery，2002，131（1）：50-58.

[8] 歐陽樂軍，李莉梅，馬銘賽，等.CRISPR/Cas9技術發(fā)展及其應用進展[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2019，47（10）：34-40.

[9]? ZHANG Y，SHOWALTER A M.CRISPR/Cas9 genome editing technology： A valuable tool for understanding plant cell wall biosynthesis and function[J].Frontiers in plant science，2020，11：1-14.

[10] 李曉開，龍科任，麥苗苗，等.CRISPR-Cas9技術的原理及其在豬研究中的應用[J].生命科學，2018，30（6）：690-700.

[11] MANGHWAR H，LINDSEY K，ZHANG X L，et al.CRISPR/cas system：Recent advances and future prospects for genome editing[J].Trends in plant science.，2019，24（12）：1102-1125.

[12] 白祥慧.CRISPR/Cas9基因敲除研究進展[J].現代畜牧獸醫(yī)，2021（1）：90-92.

[13]? WANG K K，OUYANG H S，XIE Z，et al.Efficient generation of myostatin mutations in pigs using the CRISPR/Cas9 system[J].Scientific reports，2015，5：1-11.

[14] 張婷婷，楊漫漫，魏強，等.CRISPR/Cas9介導人HBB基因突變體在豬成纖維細胞的靶向敲入[J].中國實驗動物學報，2020，28（6）：779-787.

[15] 許金蔓，徐磊，彭玥晗，等.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建豬PFKM基因定點突變細胞株[J].揚州大學學報（農業(yè)與生命科學版），2020，41（4）：36-39.

[16] 曹興林，惲君雯，陳麗，等.基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的MDCK細胞IFN-β1編碼序列的敲除[J].江蘇農業(yè)科學，2020，48（7）：59-65.

[17] 李忠慧.CRISPR/cas9基因編輯技術在羊毛品質改良中的應用[J].飼料博覽，2020（11）：32-34.

[18] 陳贏男，陸靜.CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木基因編輯中的應用[J].遺傳，2020，42（7）：657-668.

[19] 張宗飛，劉媛媛，歐陽解秀，等.水稻OsFRK1與OsFRK2基因CRISPR敲除突變體的構建[J].湖南農業(yè)大學學報（自然科學版），2020，46（6）：679-685，741.

[20] 李孟珠，王高鵬，巫月，等.水稻蔗糖轉運蛋白OsSUT4參與蔗糖轉運的功能研究[J].中國水稻科學，2020，34（6）：491-498.

[21] 李星坤，潘慧，李攀，等.基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的擬南芥ugt84a1/ugt84a2雙突變體制作及突變位點分析[J].江蘇農業(yè)科學，2020，48（20）：49-55.

[22] 李鵬.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯擬南芥ILR3基因及功能驗證[J].江蘇農業(yè)科學，2020，48（14）：78-82.

[23]? BADHAN S，BALL A S，MANTRI N.First report of CRISPR/Cas9 mediated DNA-free editing of and 4CL and RVE7 genes in chickpea protoplasts [J].International journal of molecular sciences，2021，22（1）：1-15.

[24] 張昆，陳景超，李祎，等.CRISPR/Cas9技術在微生物研究中的應用進展[J].微生物學通報，2018，45（2）：451-464.

[25] 富國文，單春蘭，敖平星，等.應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建大腸埃希氏菌irp2基因缺失株[J].動物醫(yī)學進展，2021，42（1）：50-55.

[26] 劉磊，李娜，姜雪雍，等.CRISPR/Cas9技術敲除釀酒酵母gpd2基因對產2，3-丁二醇的影響[J].中國農學通報，2020，36（29）：69-77.

[27] 李夢琦，張可心，鄭飛云，等.Lager酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)的構建[J].東北農業(yè)大學學報，2020，51（3）：36-44，96.

[28] 胡婧，馮金榮.整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建白念珠菌MTQ2基因缺失株及其表型分析[J].中國病原生物學雜志，2020，15（9）：993-996，1004.

[29]? HUANG W P，DU Y J，YANG Y，et al.Two CRISPR/Cas9 systems developed in Thermomyces dupontii and characterization of key gene functions in thermolide biosynthesis and fungal adaptation[J/OL].Applied and environmental microbiology，2020，86（20）[2020-11-17].https：//doi.org/10.1128/AEM.01486-20.

[30] 李鳳麗，石素華，李愛芹，等.CRISPR/Cas9基因編輯技術研究進展[J].山東農業(yè)科學，2020，52（4）：164-172.

[31] 田甜，周小明.基于CRISPR/Cas9的基因分析方法研究進展[J].激光生物學報，2020，29（1）：18-25.

[32] 信欣，陳麗杰，薛闖.CRISPR-Cas9技術在細菌中的研究進展及應用[J].微生物學雜志，2018，38（6）：97-102.