玻色因相關(guān)物質(zhì)研究

古鳳強(qiáng) 暢水平 張淼 楊穎潔 傳雅萍

羥丙基四氫吡喃三醇是玻色因的主要功效成分，具有多種可能的異構(gòu)體構(gòu)型。我們采用HPLC法對(duì)市售多家玻色因活性成分進(jìn)行了比較分析，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了差向異構(gòu)化反應(yīng)是其不同構(gòu)型的產(chǎn)生條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以D-木糖為原料，生成的玻色因是D-木糖衍生物β-構(gòu)型N式結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體（比例50/50）組成，市售某些廠家的玻色因產(chǎn)品主成分是其差向異構(gòu)化產(chǎn)物。

玻色因（Pro-XylaneTM）是歐萊雅集團(tuán)自主研發(fā)的化妝品原料商品名，其活性成分化學(xué)名為羥丙基四氫吡喃三醇。目前國(guó)內(nèi)化妝品原料界將羥丙基四氫吡喃三醇等同稱(chēng)作玻色因。玻色因能夠修復(fù)皮膚屏障，促進(jìn)膠原蛋白再生，增加皮膚彈性和緊致度，從而具有抗衰作用，因此受到了化妝品生產(chǎn)企業(yè)和愛(ài)美人士的廣泛關(guān)注。2019年專(zhuān)利到期后，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上如雨后春筍般出現(xiàn)了眾多的玻色因產(chǎn)品。由于玻色因產(chǎn)品缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)上的玻色因產(chǎn)品良莠不齊，其含量差異從30%到90%以上，外觀顏色從無(wú)色到橙黃色不等，產(chǎn)品優(yōu)劣難分，極其容易出現(xiàn)假貨，進(jìn)而引發(fā)化妝品安全事件。

玻色因是歐萊雅的專(zhuān)利產(chǎn)品，市場(chǎng)上尚未有其法定標(biāo)準(zhǔn)品[1]，羥丙基四氫吡喃三醇異構(gòu)體較多。那么，究竟什么樣結(jié)構(gòu)的玻色因是目標(biāo)物，亟需進(jìn)行研究和探討。基于此，我們用D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來(lái)蘇糖為原料，采用避免差向異構(gòu)和增強(qiáng)差向異構(gòu)化反應(yīng)的不同實(shí)驗(yàn)[2]，借助高效液相色譜法分析其產(chǎn)物，通過(guò)比較譜圖差異，論證差向異構(gòu)化是造成玻色因異構(gòu)體的主要原因，根據(jù)空間穩(wěn)定性理論和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定玻色因目標(biāo)產(chǎn)物主要是D-木糖衍生物β-構(gòu)型N式結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體（比例50/50）組成。

市售玻色因液相圖譜比較

儀器、試劑

液相色譜：皖儀LC3000，ELSD檢測(cè)器;

色譜柱：ChromCoreHILIC-Amide（5μm，4.6×250mm）;

流動(dòng)相：乙腈：甲醇：水=80∶15∶5;

流速：1mL/min;

柱溫：30℃;

進(jìn)樣量：20μL。

測(cè)定步驟

取適量樣品，用流動(dòng)相制成3mg/mL溶液，HPLCELSD

測(cè)定，液相色譜圖如圖1～6所示：

從以上譜圖可看出，幾個(gè)廠家的玻色因液相色譜出峰個(gè)數(shù)和位置相同，含量高低有差異。

玻色因合成產(chǎn)物剖析

玻色因是用木糖和乙酰丙酮縮合，再經(jīng)還原反應(yīng)而得到的[3]。木糖是五碳糖，在水溶液中，它在一定條件下會(huì)發(fā)生旋變反應(yīng)和差向異構(gòu)化反應(yīng)[4]。我們?cè)谘芯坎Ｉ蚝铣晒に嚨倪^(guò)程中[5-7]，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物比較復(fù)雜，通過(guò)核磁檢測(cè)分析，這幾種物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，推斷是同分異構(gòu)體。

木糖的差向異構(gòu)體主要包括阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、核糖（還可以形成核酮糖和木酮糖，只不過(guò)形成這兩種糖比較困難，在此不做深入研究）。

比較穩(wěn)定的五碳糖結(jié)構(gòu)式

從上述結(jié)構(gòu)分析可知，空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的五碳糖結(jié)構(gòu)主要包括六種：D-木糖N式、L-木糖A式、D-阿拉伯糖N式、L-阿拉伯糖A式、D-來(lái)蘇糖N式、L-來(lái)蘇糖A式。

木糖衍生物

不考慮旋光異構(gòu)體，這是幾個(gè)比較穩(wěn)定的衍生物。根據(jù)分子中羥基的位置，結(jié)合上述結(jié)構(gòu)分析，D-木糖衍生物β構(gòu)型N式的穩(wěn)定性最好，這個(gè)是主產(chǎn)品;D-木糖衍生物α-構(gòu)型N式相對(duì)于β-構(gòu)型要少得多，為次要產(chǎn)品;L-木糖衍生物理論上是可以生成的，但相對(duì)于D-木糖衍生物會(huì)更少;L-木糖衍生物α構(gòu)型比β構(gòu)型穩(wěn)定。所以，L-木糖衍生物應(yīng)該以α構(gòu)型A式為主。

阿拉伯糖衍生物（玻色因類(lèi)似物——異構(gòu)體）

從上述結(jié)構(gòu)分析，D-阿拉伯糖衍生物α構(gòu)型N式比D-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型N式穩(wěn)定，N式比A式穩(wěn)定。所以阿拉伯糖衍生物（玻色因類(lèi)似物）的穩(wěn)定性順序?yàn)椋?/p>

D-阿拉伯糖衍生物α構(gòu)型N式>D-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型N式>L-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型A式>L-阿拉伯糖衍生物α構(gòu)型A式。

即在玻色因合成過(guò)程中異構(gòu)化產(chǎn)物以D-阿拉伯糖衍生物α構(gòu)型N式為主。其余兩個(gè)可能是D-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型N式和L-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型A式。

來(lái)蘇糖衍生物

從上面結(jié)構(gòu)分析，穩(wěn)定性的順序?yàn)椋?/p>

L-來(lái)蘇糖衍生物β構(gòu)型A式>L-來(lái)蘇糖衍生物α構(gòu)型A式>D-來(lái)蘇糖衍生物α構(gòu)型N式>D-來(lái)蘇糖衍生物β構(gòu)型N式

由此分析，在合成玻色因的過(guò)程中有可能形成的相關(guān)物質(zhì)是L-來(lái)蘇糖衍生物β構(gòu)型A式和L-來(lái)蘇糖衍生物α構(gòu)型A式。

綜上所述，空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的五碳糖結(jié)構(gòu)主要包括五種：D-木糖衍生物β構(gòu)型N式、D-阿拉伯糖衍生物α構(gòu)型N式、D-阿拉伯糖衍生物β構(gòu)型N式、D-木糖衍生物α-構(gòu)型N式、L-來(lái)蘇糖衍生物β構(gòu)型A式。

為進(jìn)一步確定玻色因產(chǎn)品和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，我們分別以D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來(lái)蘇糖為原料，在避免或加強(qiáng)差向異構(gòu)化反應(yīng)的條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，經(jīng)還原后得到產(chǎn)物，經(jīng)HPLC、NMR測(cè)定，分析論證確定玻色因產(chǎn)品和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)論證

試劑、儀器

木糖：濟(jì)南圣泉集團(tuán)股份有限公司

乙酰丙酮：南京東方之珠工貿(mào)有限公司

碳酸氫鈉、硼氫化鈉、氫氧化鈉：科密歐試劑

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儀器。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）將40.0g純化水抽入100mL反應(yīng)瓶中，攪拌下于60～70℃依次投入D-木糖10.0g，加入6.6g乙酰丙酮，分批加入12.0g碳酸氫鈉，反應(yīng)1h，過(guò)濾除鹽;反應(yīng)液在30～40℃加入硼氫化鈉2.5g還原，再除鹽;母液濃縮，得到產(chǎn)品。由此方法[8，9]合成的產(chǎn)物液相色譜圖（如圖7所示）。

（2）將（1）中碳酸氫鈉換成5g氫氧化鈉，其他與上述步驟相同，合成產(chǎn)物液相色譜圖（如圖8所示）。

（3）以D-阿拉伯糖作原料，操作步驟與（1）相同，合成產(chǎn)物液相色譜圖（如圖9所示）。

（4）將（2）和（3）產(chǎn)物混合，液相色譜圖（如圖10所示）。

（5）以L-來(lái)蘇糖為原料，操作步驟與（1）相同，合成產(chǎn)物液相色譜圖（如圖11所示）。

（6）將（1）中產(chǎn)物制成固含量為50%玻色因樣品，送某知名第三方檢測(cè)公司與羥丙基四氫吡喃三醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較分析，NMR氫譜和碳譜結(jié)果（如圖12和圖13所示）。

結(jié)果與分析

（1）玻色因產(chǎn)品構(gòu)型鑒定

以D-木糖為原料，以碳酸氫鈉作堿，采用避免差向異構(gòu)化的方法，經(jīng)還原得到的產(chǎn)品，先后經(jīng)高效液相色譜（HPLC，圖7）、核磁共振氫譜（1H-NMR，圖12）和碳譜（13C—NMR，圖13）等測(cè)定方法確定了產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和質(zhì)量，測(cè)試結(jié)果如下：

由圖7可知，采用避免差向異構(gòu)化得到的玻色因產(chǎn)品純度高達(dá)98%，先后在10.0min、11.1min、15.7min和17.1min出現(xiàn)四種少量的差向異構(gòu)化產(chǎn)物。

圖12是產(chǎn)品1H-NMR（馬來(lái)酸為內(nèi)標(biāo)物）測(cè)試圖，其測(cè)試結(jié)果如下：1H-NMR（400MHZ，D2O）δ1.11～1.14（dd，3H），1.41～1.81（m，2H），3.08～3.15（m，1H），3.17～3.23（m，1H），3.28～3.35（m，1H），3.47～3.53（m，1H），3.83～3.88（m，1H），3.9～3.98（m，1H）。上述數(shù)據(jù)證明該產(chǎn)品的氫化學(xué)位移值與羥丙基四氫吡喃三醇的氫化學(xué)位移預(yù)測(cè)值一致。同時(shí)，我們采用馬來(lái)酸為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)核磁共振氫譜（1H-NMR）測(cè)定玻色因的含量為97.8%，與HPLC的分析結(jié)果基本一致。

圖13是產(chǎn)品13C-NMR譜圖，羥丙基四氫吡喃三醇一共8個(gè)碳，譜圖中出現(xiàn)15個(gè)核磁碳峰，7位碳為手性碳，還原過(guò)程中產(chǎn)生兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體。從核磁碳譜計(jì)算可知，兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體比例為50/50，該核磁碳譜數(shù)據(jù)與歐萊雅公開(kāi)的玻色因[9]一致。

綜上所述，以D-木糖為原料，采用避免差向異構(gòu)化的方法，經(jīng)還原得到的產(chǎn)品才是合格的玻色因產(chǎn)品。

（2）差向異構(gòu)化反應(yīng)探索

為了進(jìn)一步搞清玻色因產(chǎn)品中出現(xiàn)的四種差向異構(gòu)化產(chǎn)物的出現(xiàn)條件和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了三個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

圖8和圖7比較可知，強(qiáng)化差向異構(gòu)化反應(yīng)后，圖7的主產(chǎn)物減少，其他4個(gè)差向異構(gòu)體大幅增加。

圖9是以D-阿拉伯糖為原料，其15.07min和15.60min出峰的兩個(gè)物質(zhì)，是D-阿拉伯糖衍生物N式結(jié)構(gòu)，11.74min和12.39min的峰應(yīng)該是D-阿拉伯糖衍生物A式異構(gòu)體。

圖10是D-木糖差向異構(gòu)化反應(yīng)與D-阿拉伯糖為原料的產(chǎn)物混合后液相譜圖，基本包含了兩個(gè)混合產(chǎn)物中的所有峰，15.29min和16.06min峰與圖9中相同位置的峰相對(duì)應(yīng)，但比例正好相反，說(shuō)明在3.2的反應(yīng)中發(fā)生了差向異構(gòu)，產(chǎn)生了阿拉伯糖的一個(gè)副產(chǎn)物。

圖11是L-來(lái)蘇糖為原料的產(chǎn)物色譜圖，由于來(lái)蘇糖樣品不多，加之非常不穩(wěn)定，所以投料很少，峰面積比較小。盡管如此，也能看出來(lái)，15.08min、15.62min出現(xiàn)的兩個(gè)峰與圖8中相同位置的峰非常吻合，17.02min峰面積很小，不排除與圖8中的16.23min的峰一致。說(shuō)明，來(lái)蘇糖不穩(wěn)定，差向異構(gòu)化也很?chē)?yán)重。

如圖8～圖10的結(jié)果分析表明，以D-木糖、D-阿拉伯糖和L-來(lái)蘇糖等五碳糖為原料，與乙酰丙酮進(jìn)行反應(yīng)，在增強(qiáng)差向異構(gòu)化條件下，均容易形成相互的差向異構(gòu)化產(chǎn)物。

結(jié)論

本文通過(guò)比較市售不同廠家玻色因液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)出峰個(gè)數(shù)和位置相同，但含量不同。為探究目標(biāo)產(chǎn)物及其產(chǎn)生機(jī)理，以D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來(lái)蘇糖為原料，在避免差向異構(gòu)和增強(qiáng)差向異構(gòu)化反應(yīng)的條件下，與乙酰丙酮進(jìn)行反應(yīng)，再用硼氫化鈉還原，產(chǎn)物經(jīng)HPLC、NMR測(cè)定，根據(jù)空間穩(wěn)定性理論分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定玻色因目標(biāo)產(chǎn)物主要是D-木糖衍生物β-構(gòu)型N式結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體（比例50/50）組成。市面上有些樣品的主成分是木糖差向異構(gòu)化反應(yīng)的產(chǎn)物。