釀酒酵母Y3401產(chǎn)己酸乙酯發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉朋肖， 常 煦， 成柳潔， 丁 澤， 龔 藝， 李秀婷1，2，， 范光森1，2，*

（1 北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100048 2 北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京100048 3 北京工商大學(xué)食品學(xué)院 北京100048 4 安琪酵母股份有限公司 釀造與生物能源研究所 湖北宜昌334003）

釀酒酵母是酒飲料生產(chǎn)中的重要菌株， 不僅具有產(chǎn)乙醇能力，而且還有產(chǎn)酯能力，被廣泛應(yīng)用于白酒、啤酒和葡萄酒等產(chǎn)品釀造中，其性能的好壞直接關(guān)系這些酒飲料的出酒率和品質(zhì)[1-2]。 基于釀酒酵母對(duì)釀酒的重要性， 有關(guān)釀酒酵母的研究相對(duì)較多，主要集中于探討釀酒酵母產(chǎn)乙醇能力，探究釀酒酵母與其它微生物共培養(yǎng)時(shí)的相互作用，而有關(guān)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)酯的研究較少[3-4]。釀酒酵母產(chǎn)香（產(chǎn)酯）特性與菌種密切相關(guān)，有研究表明不同釀酒酵母發(fā)酵相同原料時(shí)所產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)差異顯著， 篩選既能高產(chǎn)乙醇又具有突出產(chǎn)酯能力的釀酒酵母菌株在酒飲料生產(chǎn)中至關(guān)重要[5-6]。 在日本清酒研究中， 分離獲得一株高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母（清酒酵母）Kyokai No.7，并在清酒釀造中進(jìn)行應(yīng)用， 后續(xù)又通過化學(xué)誘變技術(shù)獲得高產(chǎn)己酸乙酯（產(chǎn)乙醇能力未受到影響）的突變菌株，進(jìn)一步提高了清酒的品質(zhì)[7-9]。

白酒是我國(guó)國(guó)酒， 科研工作者應(yīng)在傳承基礎(chǔ)上對(duì)其創(chuàng)新，從而將其發(fā)揚(yáng)光大。 在這一過程中，系統(tǒng)研究我國(guó)白酒釀造過程中的重要功能微生物是重中之重， 是揭開我國(guó)白酒釀造神秘面紗的突破口，是走向智能化調(diào)控釀造的基礎(chǔ)。 眾所周知，釀酒酵母是白酒釀造中眾多微生物中優(yōu)先關(guān)注的菌株之一， 研究我國(guó)白酒釀造中的釀酒酵母多樣性及其功能對(duì)于提高我國(guó)白酒品質(zhì)具有重要意義[3]。濃香型白酒是我國(guó)生產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的白酒品種，以濃香型白酒為研究對(duì)象具有典型性。己酸乙酯是濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)， 是評(píng)價(jià)濃香型白酒品質(zhì)的重要指標(biāo)， 提高濃香型白酒釀造中己酸乙酯含量有利于提升其品質(zhì)， 提高優(yōu)質(zhì)酒率[10]。 傳統(tǒng)濃香型白酒釀造過程中，己酸乙酯主要在發(fā)酵后期由己酸和乙醇在酯化酶作用下發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生， 其中己酸是由生活于窖泥內(nèi)部的己酸菌產(chǎn)生， 其所產(chǎn)己酸只有滲透到窖泥外層中的酒醅中才能有機(jī)會(huì)與乙醇酯化產(chǎn)生己酸乙酯，這正是濃香型白酒發(fā)酵周期長(zhǎng)， 糧耗高的原因之一[11-12]。 釀酒酵母是白酒釀造中不可缺少的菌株，其可通過醇?；D(zhuǎn)移酶催化合成己酸乙酯， 如能獲得高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母， 將會(huì)對(duì)濃香型白酒釀造發(fā)揮重要作用。 肖冬光團(tuán)隊(duì)一直致力于通過分子生物學(xué)改造白酒釀酒酵母， 獲得了多株性能優(yōu)良的高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母菌株， 對(duì)于提升我國(guó)白酒品種具有重要的意義[12-15]。我國(guó)不同地域、不同釀造工藝、不同香型白酒釀造中的微生物種群存在較大差異， 相同菌屬之間由于環(huán)境的長(zhǎng)期選擇也存在多樣性，其特性也有所不同，從釀造環(huán)境中通過傳統(tǒng)篩選獲得性能優(yōu)良的功能微生物菌株是探究白酒釀造的重要有效途徑， 因此采用篩選分離方法獲得高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母不僅行之有效， 而且不失為提高濃香型白酒釀造中己酸乙酯含量的有效途徑之一， 研究和選育高產(chǎn)己酸乙酯釀酒酵母菌株具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[3-4，16]。研究團(tuán)隊(duì)前期篩選獲得一株高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母Y3401，在研究其產(chǎn)香特性時(shí)發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)己酸乙酯（在提供前體物質(zhì)己酸時(shí)）， 并且其產(chǎn)量高于大多數(shù)釀酒酵母產(chǎn)己酸乙酯能力（一般在0.5 mg/L 左右）[4，17-18]。 目前，有關(guān)我國(guó)白酒來源的釀酒酵母產(chǎn)己酸乙酯的研究較少。 本文通過單因素、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯條件， 為其在白酒中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）Y3401為北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院食品微生物及酶技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室自行篩選及保存。

乙醇、己酸、己酸乙酯，Sigma 公司；色譜級(jí)正庚烷，麥克林公司；耐高溫α-淀粉酶、糖化酶，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨等試劑均為國(guó)產(chǎn)生物或分析純級(jí)試劑； 高粱購(gòu)自于河南許昌地區(qū)。

YPD 培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃條件下滅菌20 min。

高粱酶解液參考Fan 等[19]的方法：250 g 高粱粉碎至100 目以下后， 按照固液比1∶4 加入蒸餾水，煮沸糊化后，利用耐高溫α-淀粉酶于90 ℃下液化1 h，冷卻至60 ℃，加入糖化酶糖化2 h。 糖化后，趁熱過濾后于室溫離心10 min，離心轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，上清液糖度調(diào)至8 Brix 后分裝于三角瓶中（30 mL/250 mL），115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器和設(shè)備

YQX-SG46-280S 高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCN-1360 型生物潔凈工作臺(tái)， 北京東聯(lián)哈爾儀器公司； 電子天平、pH計(jì)， 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LHS-100CL 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒儀器設(shè)備有限公司；TU-19 紫外-可見分光光度計(jì)， 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Microfuge 2R 離心機(jī)，北京田林恒泰科技有限公司；1260series 高效液相色譜儀，Agilent 科技有限公司；TSQTM8000 evo 三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯條件優(yōu)化

1.3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 將釀酒酵母Y3401 接種于YPD 液體培養(yǎng)基中于28 ℃活化培養(yǎng)24 h， 按照0.3%接種量接種于高粱酶解液培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)24 h， 完成第1 階段細(xì)胞的積累，然后加入2%乙醇和0.02%己酸繼續(xù)培養(yǎng)，完成第2 階段己酸乙酯的合成。 采用單因素一一考察培養(yǎng)基條件（糖度和pH 值）及其第2 階段發(fā)酵條件（溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、乙醇添加量、己酸添加量、前體添加時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間） 對(duì)釀酒酵母合成己酸乙酯的影響，具體因素與水平見表1。 每組試驗(yàn)做3個(gè)平行， 得到的每個(gè)因素的最優(yōu)水平用于后續(xù)試驗(yàn)，通過氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）檢測(cè)其己酸乙酯含量。

表1 單因素及其實(shí)驗(yàn)水平Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.1.2 PB 試驗(yàn) 以上述考察的單因素及其水平為基礎(chǔ)， 本試驗(yàn)選用n=17 的PB 設(shè)計(jì)對(duì)8 個(gè)因素（乙醇添加量、己酸添加量、接種量、pH 值、轉(zhuǎn)速、前體添加時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度）進(jìn)行考察，每個(gè)因素取+1 和-1 兩個(gè)水平，本試驗(yàn)取單因素實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)水平兩端具有顯著性差異的水平作為+1 和-1 兩個(gè)水平，響應(yīng)值為己酸乙酯含量（mg/L），編碼水平如表2 所示，用軟件Design-Expert 11（Stat-Ease，Inc. USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較各因素的t 值和可信度。

表2 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 2 Factors and levels of the variables in PB design

1.3.1.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)得到了對(duì)響應(yīng)值最顯著的5 個(gè)因素， 將這5 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，依據(jù)PB 試驗(yàn)獲得的回歸模型和試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定5 個(gè)因素的步移方向和步長(zhǎng)， 共設(shè)置5個(gè)梯度，每個(gè)梯度3 個(gè)平行，其余條件按照單因素最優(yōu)值進(jìn)行， 采用GC-MS 檢測(cè)己酸乙酯含量，最終確定后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中的顯著因素范圍， 確定試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

1.3.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)1.3.1.2 節(jié)和1.3.1.3節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，采用接種量、己酸乙酯添加量和誘導(dǎo)時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)， 中心點(diǎn)為爬坡試驗(yàn)中己酸乙酯含量最高組（第2 組）對(duì)應(yīng)因素的取值。 利用軟件Design-Expert 11 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）及數(shù)據(jù)分析。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及編碼水平Table 3 Factors and levels for the Box-Behnken design

1.3.2 己酸乙酯含量測(cè)定方法 將發(fā)酵液離心，取上清液與正庚烷等體積混合， 萃取2 min 后取有機(jī)相部分于1.5 mL 離心管中，加入適量無水硫酸鈉除去痕量水。 用有機(jī)濾膜過濾后采用GC-MS檢測(cè)己酸乙酯含量。 GC-MS 色譜條件參照Fan 等[19]方法，毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；分流比為37∶1；采用程序升溫，升溫程序?yàn)?0 ℃，保留2 min，以10 ℃/min 速率升至180 ℃，保留2 min，再以6 ℃/min 速率升至230 ℃，保留2 min；檢測(cè)器溫度250℃；載氣為He，流速1 mL/min；EI 電離源，電子能量70 eV；掃描范圍50～350 amu；離子源溫度250℃；接口溫度250 ℃。

己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用外標(biāo)法， 準(zhǔn)確稱取0.0869 g 己酸乙酯純品，用正庚烷定容至100 mL， 分別將其稀釋至20，50，100，200，400 倍，經(jīng)GC-MS 檢測(cè)其峰面積， 以己酸乙酯含量為x 軸，峰面積為y 軸，繪制己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 每組試驗(yàn)進(jìn)行3 個(gè)平行， 采用SPSS 21.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析；利用Excel 2016 和Design-Expert 11 繪圖軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 高粱酶解液糖度對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響 鑒于本文所選用菌株釀酒酵母Y3401 篩選自白酒釀造環(huán)境， 并且主要探究其在白酒釀造中的應(yīng)用潛力，為此，本研究采用白酒釀造主要原料高粱的酶解液為發(fā)酵培養(yǎng)基探究其合成己酸乙酯能力。 高粱酶解液糖度反映了其含有葡萄糖等還原糖的濃度，糖度不同，則含有的酵母所能利用的碳水化合物濃度不同，從而影響到酵母的生長(zhǎng)、繁殖和代謝。由圖1 可見，隨著高粱酶解液糖度的不斷增加， 釀酒酵母Y3401 所產(chǎn)己酸乙酯的質(zhì)量濃度不斷增加， 在高粱酶解液糖度最高時(shí)產(chǎn)量最大，達(dá)到3.1 mg/L。 高粱酶解液中可利用碳水化合物是酵母生長(zhǎng)繁殖的動(dòng)力能源， 對(duì)其合成己酸乙酯具有重要影響，當(dāng)糖度較低時(shí)，酵母的生長(zhǎng)繁殖受到可利用碳水化合物含量不足的影響， 其所產(chǎn)己酸乙酯含量較低；隨著糖度的增高，可利用碳水化合物含量提高，從而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和繁殖，有利于己酸乙酯的合成。 不同菌株合成酯類化合物所需要的高粱酶解液糖度不同， 這是由其對(duì)糖溶液的耐受不同及其所合成酯類化合物種類有關(guān)[19-20]。如鐘姝霞等[21]優(yōu)化異常畢赤酵母Y2 合成乙酸乙酯最佳高粱酶解液糖度為12 Brix；而Fu 等[20]優(yōu)化異常威克漢姆酵母YF1503 產(chǎn)乙酸乙酯最佳高粱酶解液糖度為8.5 Brix。 本研究所采用高粱經(jīng)酶解處理后最高糖度為14 Brix， 故在PB 試驗(yàn)時(shí)不再進(jìn)行考察。

圖1 高粱浸出液糖度對(duì)釀酒酵母Y3401產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.1 Effect of sugar content of sorghum extract on ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.2 高粱酶解液pH 值對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響 環(huán)境pH 值不僅影響酵母的生長(zhǎng)繁殖，而且還會(huì)影響其代謝途徑，尤其是與代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的活力， 對(duì)酵母合成有關(guān)代謝產(chǎn)物起到重要調(diào)控作用[3]。 通過優(yōu)化高粱酶解液初始pH值發(fā)現(xiàn)（圖2），隨著培養(yǎng)基初始pH 值的升高，釀酒酵母Y3401 合成己酸乙酯的質(zhì)量濃度先增加后下降，當(dāng)初始pH 值為7.0 時(shí)，己酸乙酯合成量最高，為2.4 mg/L。前期已有研究結(jié)果表明該酵母能在較寬廣的pH 值范圍（4～9）內(nèi)生長(zhǎng)良好，這表明pH 值可能主要是通過影響酵母代謝合成己酸乙酯途徑中相關(guān)酶的活力調(diào)控己酸乙酯的合成。值得注意的是， 該菌株在pH=4 時(shí)合成很少量己酸乙酯， 而在pH≥5 時(shí)合成較高量的己酸乙酯，依據(jù)張浩等[22]研究的結(jié)果可以判斷發(fā)酵過程中所產(chǎn)己酸乙酯主要來源于釀酒酵母Y3401 的生物合成作用， 而由前體物質(zhì)乙醇和己酸化學(xué)合成己酸乙酯的量可忽略。

圖2 高粱浸出液pH 值對(duì)釀酒酵母Y3401產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.2 Effect of pH value of sorghum extract on ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.3 溫度對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響溫度對(duì)酵母的生長(zhǎng)影響較大， 合適的溫度有利于酵母生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。本試驗(yàn)首先采用28℃完成該酵母細(xì)胞的積累， 然后選取18～30 ℃的范圍考察溫度對(duì)酵母合成己酸乙酯的影響。 由圖3 可以看出，在己酸乙酯合成階段，隨著培養(yǎng)溫度的升高，己酸乙酯含量先增加后降低，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)， 酵母Y3401 合成己酸乙酯的量最高，達(dá)1.9 mg/L。 較高或者較低溫度不僅影響酵母的繼續(xù)生長(zhǎng)， 而且與己酸乙酯合成相關(guān)酶活力也會(huì)受到溫度的影響， 從而不利于己酸乙酯的合成[19]。

圖3 溫度對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.3 Effect of temperature on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.4 轉(zhuǎn)速對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速會(huì)影響到培養(yǎng)基溶氧量， 進(jìn)而影響到微生物的生長(zhǎng)[3]。本文考察了轉(zhuǎn)速對(duì)酵母Y3401合成己酸乙酯的影響，結(jié)果如圖4 所示，隨著轉(zhuǎn)速的提高， 酵母Y3401 合成己酸乙酯的質(zhì)量濃度先增加后降低，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，己酸乙酯產(chǎn)量最高，達(dá)1.6 mg/L，顯著高于其它轉(zhuǎn)速條件。 轉(zhuǎn)速的變化對(duì)酵母的生長(zhǎng)和代謝有一定的影響，轉(zhuǎn)速過低溶氧水平低，會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速過高，一方面會(huì)抑制糖酵解途徑，減少乙醇合成前體物質(zhì)，降低乙醇得率而影響己酸乙酯的合成，另一方面則是高剪切力和高氧濃度下會(huì)增加己酸對(duì)細(xì)胞的毒害作用下， 從而影響菌體正常生長(zhǎng)和生理代謝，進(jìn)而影響合成己酸乙酯速率[3，23]。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.4 Effect of rotation speed on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.5 接種量對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響接種量不僅會(huì)影響微生物生長(zhǎng)規(guī)律， 尤其是延緩期的長(zhǎng)短， 而且會(huì)影響微生物代謝產(chǎn)物的積累[3]。合適的接種量，有利于目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。由圖5 可以看出，隨著接種量的增加，酵母Y3401 合成的己酸乙酯質(zhì)量濃度先增加后降低， 當(dāng)接種量為2%時(shí)，己酸乙酯產(chǎn)量最高，達(dá)6.8 mg/L。一般來看，接種量過少，酵母生長(zhǎng)的延緩期較長(zhǎng)，第1 階段細(xì)胞積累量相對(duì)較低， 不利于第2 階段己酸乙酯的合成；接種量過高，雖能在第1 階段快速積累大量細(xì)胞， 但往往因大量細(xì)胞的積累已消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣， 并且加劇細(xì)胞之間對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的競(jìng)爭(zhēng)， 從而在第2 階段因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而導(dǎo)致合成己酸乙酯的速率降低[3]。

圖5 接種量對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.6 乙醇添加量對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響 乙醇是酵母Y3401 合成己酸乙酯的重要前體物質(zhì)，對(duì)酵母Y3401 合成己酸乙酯起到重要作用。由圖6 可以看出， 己酸乙酯質(zhì)量濃度隨著乙醇添加量的增加先增加后下降， 當(dāng)乙醇添加量為8%時(shí)，己酸乙酯產(chǎn)量達(dá)到最高，為3.0 mg/L。 在乙醇添加量較低時(shí)， 酵母Y3401 催化乙醇和己酸合成己酸乙酯前體不足， 因此合成的己酸乙酯質(zhì)量濃度較低；而乙醇添加量較高時(shí)，會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生一定的抑制作用， 影響其合成己酸乙酯的代謝活動(dòng)， 從而導(dǎo)致合成己酸乙酯的質(zhì)量濃度降低[19]。 Fu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母YF1503 在乙醇添加量為6%時(shí)所產(chǎn)乙酸乙酯最高，這與本文所添加乙醇量基本一致，這與酵母對(duì)乙醇耐受性有關(guān)，兩者在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～8%時(shí)受到的影響較小。值得注意的是，在未添加乙醇時(shí)也有己酸乙酯合成， 這是由于酵母Y3401 在高粱酶解液中會(huì)產(chǎn)生少量乙醇， 自身產(chǎn)生的乙醇與添加的己酸在酵母的作用下合成己酸乙酯， 然而由于該酵母在高粱酶解液中生成的乙醇含量較低（約為15 g/L）， 因此會(huì)隨著乙醇添加量的增加己酸乙酯合成有所增加； 而當(dāng)乙醇添加量增加到≥14%時(shí)， 高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)和代謝，因此未檢測(cè)到己酸乙酯的合成，進(jìn)一步證實(shí)己酸乙酯的合成需要酵母Y3401 細(xì)胞的生命活動(dòng)。

圖6 乙醇添加量對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.6 Effect of ethanol addition amount on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.7 己酸添加量對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響 己酸是酵母Y3401 合成己酸乙酯的另一重要前體物質(zhì)， 對(duì)酵母Y3401 合成己酸乙酯同樣發(fā)揮重要作用。由圖7 可以看出，隨著己酸添加量的增加， 己酸乙酯質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)與乙醇添加量類似，呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，在己酸添加量為0.04%時(shí)，酵母Y3401 合成己酸乙酯最多，為3.7 mg/L。在己酸添加量較低時(shí)，合成己酸乙酯的前體物質(zhì)含量不足，因此合成己酸乙酯的量較低，尤其是未添加己酸時(shí)，未檢測(cè)到己酸乙酯，這充分表明酵母Y3401 合成己酸乙酯需要前體物質(zhì)——己酸； 己酸添加量較高時(shí)， 會(huì)對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)生抑制，從而引起己酸乙酯質(zhì)量濃度降低。 王瑞明等[24]研究表明0.05%己酸即會(huì)對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響。 因此，己酸添加量高于0.04%時(shí)，高體積分?jǐn)?shù)的己酸對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響導(dǎo)致其合成己酸乙酯質(zhì)量濃度下降。

圖7 己酸添加量對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.7 Effect of caproic acid addition amount on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.8 前體添加時(shí)機(jī)對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響 由于前體物質(zhì)乙醇和己酸在較高體積分?jǐn)?shù)下會(huì)對(duì)酵母Y3401 生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響， 繼而影響到其代謝轉(zhuǎn)化乙醇和己酸合成己酸乙酯， 因此兩者添加時(shí)機(jī)對(duì)其合成己酸乙酯存在一定的影響。由結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)（圖8），在細(xì)胞積累培養(yǎng)中后期（第1 階段）添加前體物質(zhì)更有利于己酸乙酯的合成，其中在培養(yǎng)32 h 時(shí)添加前體物質(zhì)合成己酸乙酯的量最高，達(dá)到3.0 mg/L。 這可能是由于酵母細(xì)胞在培養(yǎng)前期對(duì)前體物質(zhì)比較敏感， 特別是較高體積分?jǐn)?shù)的前體物質(zhì)還有可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用， 并且此時(shí)合成己酸乙酯的酶在培養(yǎng)體系中積累量較少， 因此合成己酸乙酯含量較低；而較遲添加前體物質(zhì)，雖然細(xì)胞濃度較高，但由于培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降， 細(xì)胞代謝活動(dòng)受到部分影響， 從而引起代謝轉(zhuǎn)化生成己酸乙酯能力下降。

圖8 前體添加時(shí)機(jī)對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.8 Effect of pre-induced period on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.1.9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響圖9 表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母Y3401 合成己酸乙酯含量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)， 在16～24 h 內(nèi)，己酸乙酯合成量最高。 值得注意的是，在未添加乙醇和己酸前體發(fā)酵的24 h 內(nèi)，未檢測(cè)到己酸乙酯的含量，這表明，在沒有前體物質(zhì)（尤其是己酸）存在時(shí)，酵母Y3401 不能合成己酸乙酯，即進(jìn)一步證實(shí)該酵母合成己酸乙酯需要己酸前體物質(zhì)的存在。加入前體物質(zhì)后，由于前期積累了大量的酵母細(xì)胞及對(duì)應(yīng)合成己酸乙酯需要的酶，因此通過生物代謝能快速積累己酸乙酯； 而隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，前體物質(zhì)不斷消耗，合成己酸乙酯的含量不斷降低，并且，酵母會(huì)通過其它對(duì)應(yīng)的代謝途徑將己酸乙酯轉(zhuǎn)化為其它代謝產(chǎn)物， 從而導(dǎo)致己酸乙酯含量的逐漸降低， 這與其它酯類化合物的合成變化規(guī)律類似[19]。

圖9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)釀酒酵母Y3401 產(chǎn)己酸乙酯的影響Fig.9 Effect of induced period on the ethyl caproate production by S. cerevisiae Y3401

2.2 PB 試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 選取單因素結(jié)果中最優(yōu)水平為中心值， 設(shè)計(jì)了11 因素n=17 的PB 試驗(yàn)（5 個(gè)中心值，設(shè)置3 個(gè)虛擬項(xiàng)X9，X10和X11），試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示， 每組試驗(yàn)的響應(yīng)值取3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

表4 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及產(chǎn)己酸乙酯結(jié)果Table 4 Experimental design of PB and the results for ethyl caproate production

通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析， 可得最優(yōu)回歸方程為：

Y=3.35-0.3667X1+0.8667X2+1.2800X3-0.4167X4-0.1000X5-0.3833X6+0.5500X7-0.2667X8

為進(jìn)一步分析各因素對(duì)合成己酸乙酯的影響，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析（表5）和顯著性分析（表6）。 從表5 中可以看出，回歸模型的F 值為14.81，相應(yīng)的P 值為0.0005，小于0.001，說明該模型極顯著。 相關(guān)系數(shù)R2=0.9368，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間高度相關(guān)， 說明該模型可以很好的模擬合成己酸乙酯的發(fā)酵過程，擬合程度高，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。從表6 可以看出，對(duì)合成己酸乙酯影響顯著的因素是接種量、己酸添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、pH 值和前體添加時(shí)機(jī)，可信度均在97%以上，因此選擇以上5 個(gè)顯著因素作為下一步爬坡試驗(yàn)的對(duì)象，進(jìn)行下一步優(yōu)化。對(duì)于其它因素，則由于其對(duì)合成己酸乙酯的影響不顯著， 故選取單因素中最優(yōu)水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表5 PB 試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 5 Regression equation analysis of variance in PB design

表6 PB 試驗(yàn)?zāi)Ｐ推貧w系數(shù)與顯著性檢驗(yàn)分析Table 6 Model partial regression coefficient and significance analysis in PB design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果各因素的正、負(fù)效應(yīng)并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 確定各因素的最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)， 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。 由表7 可見，己酸乙酯含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)， 第2 組試驗(yàn)己酸乙酯產(chǎn)量最高， 即接種量3%，己酸添加量0.04%，誘導(dǎo)時(shí)間30 h，pH=7，前體添加時(shí)機(jī)為30 h 時(shí)，己酸乙酯產(chǎn)量為9.2 mg/L，說明此時(shí)比較接近最佳響應(yīng)區(qū)域。 因此， 結(jié)合Plackett-Burman 中因素顯著性， 選擇第2 組中的接種量、己酸添加量、誘導(dǎo)時(shí)間3 個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和中心點(diǎn)。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental designs and the results of steepest ascent

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)

根據(jù)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 共設(shè)定17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中析因部分試驗(yàn)12 次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)為5 次，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表8， 運(yùn)用Design-Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，分析結(jié)果見表9?；貧w方程如下：

表8 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及產(chǎn)己酸乙酯結(jié)果Table 8 The Box-Behnken design and the results for ethyl caproate production

Y=9.12+1.09A+2.98B+0.9625C+0.275AB-0.25AC+0.0025BC-1.29A2-1.66B2-1.99C2

從表9 可以看出，模型P 值顯著（P＜0.0001），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明擬合程度良好，回歸方程可以很好地描述各因素和己酸乙酯產(chǎn)量的關(guān)系， 回歸方程決定系數(shù)R2=0.9882， 調(diào)整系數(shù)R2adj=0.9730，說明，該二階回歸方程可以解釋響應(yīng)面中2.7%的可變性，對(duì)試驗(yàn)擬合情況良好，方程預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間的相關(guān)性高， 可以用該方程確定己酸乙酯合成的最佳條件。

同時(shí)，由表9 可得，一次項(xiàng)A、B 和C 達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），由F 值可知，各因素對(duì)產(chǎn)己酸乙酯的影響順序?yàn)椋?己酸添加量＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間； 另外，A2、B2和C2對(duì)其曲面效應(yīng)也為極顯著。根據(jù)回歸方程，得出各因素交互作用對(duì)己酸乙酯產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖（圖10），由響應(yīng)面圖可以看出AB>AC>BC。另外，由圖還可直觀看出隨著各因素?cái)?shù)值的增加， 響應(yīng)值呈現(xiàn)先上升后略有下降趨勢(shì)，擬合曲線均為凸形，有最大值，通過Design-Expert 軟件求解方程，得到預(yù)測(cè)最優(yōu)條件與響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心值一致，即己酸添加量0.059%、接種量3.5%、誘導(dǎo)時(shí)間31 h，最終預(yù)測(cè)值為10.9 mg/mL，為驗(yàn)證結(jié)果的可信度，采用最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得己酸乙酯的含量為10.1 mg/L（結(jié)果為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值）， 與模型預(yù)測(cè)值偏差7.9%，二者基本吻合，具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。 該優(yōu)化結(jié)果相比單因素優(yōu)化最高值（6.8 mg/L）提升了48%。

圖10 各因素間相互作用的己酸乙酯產(chǎn)量響應(yīng)曲面及其等高線圖Fig.10 Response surface and contour map of ethyl caproate yield under the interaction of various factors

表9 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程方差分析Table 9 Experimental design regression equation analysis of variance of the Box-Behnken design

3 結(jié)論

釀酒酵母是白酒釀造中的重要功能菌株，其不僅影響到白酒出酒率，而且對(duì)白酒品質(zhì)也有一定的影響。 這一影響，不僅包括釀酒酵母菌株與白酒釀造環(huán)境中微生物菌群相互作用而引起釀造環(huán)境中微生物菌群特定的規(guī)律變化，還包括釀酒酵母本身所產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)。 為此，本文對(duì)前期篩選獲得的一株高產(chǎn)乙醇并具有突出產(chǎn)酯能力的釀酒酵母Y3401 合成己酸乙酯條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。 通過，單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)，最終獲得其產(chǎn)己酸乙酯的條件為： 高粱培養(yǎng)基糖度為14 Brix、初始pH=7、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量3.5%、乙醇添加量8%、己酸添加量0.059%、前體添加時(shí)間30 h、誘導(dǎo)時(shí)間31 h。 在此培養(yǎng)條件下，其合成己酸乙酯量為10.1 mg/L，較優(yōu)化前有了大幅提升，為其更好應(yīng)用于白酒釀造中提供了良好的理論基礎(chǔ)。