平板計數(shù)法測定果酒中菌落總數(shù)的不確定度分析

張瀟月

摘 要：為了提高實驗室檢測結(jié)果的準確度，本文結(jié)合食品微生物檢驗菌落總數(shù)測定的最新標準與評定測量不確定度的相關(guān)規(guī)定要求，分析果酒中菌落總數(shù)不確定度的來源，采用合并樣本標準差的方法來評定菌落總數(shù)的不確定度。結(jié)果建立了果酒中菌落總數(shù)的不確定度評定方法，測量不確定的擴展不確定度為0.079 3。

關(guān)鍵詞：菌落總數(shù);不確定度;果酒

Uncertainty Analysis of Total Number of Colonies in Fruit Wine by Plate Counting Method

ZHANG Xiaoyue

（Wuliangye Group Co.， Ltd.， Yibin 644007， China）

Abstract： In order to improve the accuracy of laboratory test results， the latest standards for total bacterial count determination of food microbiological test and related requirements for evaluation of measurement uncertainty was combined in this paper， the source of total uncertainty of bacteria in fruit wine was analyzed and the method of uniting standard deviation was applied to determine the uncertainty of the colony. The results showed that the method was established to evaluate the uncertainty of total number of bacteria in fruit wine， and the extended uncertainty of measurement uncertainty was 0.0793.

Keywords： total number of colonies; uncertainty; fruitwine

隨著實驗室認可和資質(zhì)認定工作的開展[1]，根據(jù)《General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories》（IS0/IEC 17025：2017）中相關(guān)規(guī)定[2]，測量不確定度評定是檢驗檢測實驗室必備的能力之一，因此越來越多的實驗室意識到測量不確定度評定的重要性[3]，在實驗室的日常檢測中，積極開展方法不確定度評定工作。但不確定度在微生物檢驗工作中應(yīng)用較少。本文對果酒中菌落總數(shù)計數(shù)檢驗結(jié)果進行不確定度評定[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

CICC10389大腸埃希氏菌、CICC10293產(chǎn)氣腸桿菌和CICC10384金黃色葡萄球菌，中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心;平板計數(shù)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司;培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電子天平，奧豪斯（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

試驗參考《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[5]、《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）。

1.3 樣品制備

3種標準菌株混合培養(yǎng)24 h，取新鮮的混合液培養(yǎng)物于滅菌的0.85%的生理鹽水中，制作成0.5麥氏濃度的溶液，然后稀釋10倍制成約為1×105 CFU/mL的菌懸液。取上述菌懸液1 mL加入500 mL已滅菌的果酒中，充分混勻作為樣品檢測原液。用25 mL的大肚吸管分別吸取25 mL樣品檢測原液，放入

10支已滅菌的放有玻璃珠的500 mL的三角瓶中。

1.4 測量過程

1.4.1 稀釋樣品

以無菌操作將檢樣25 mL放入含有225 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠），經(jīng)過充分振搖成1∶10的均勻稀釋液。用1 mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液

1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，混合均勻，做成1∶100的稀釋液。每遞增稀釋1次，即換用1支滅菌吸管。

1.4.2 選擇稀釋倍數(shù)

選擇2～3個適宜稀釋度。本實驗室選取10-1、10-2兩個稀釋度。分別在做10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管吸取1 mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做2個培養(yǎng)皿。

1.4.3 傾倒培養(yǎng)基

稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將冷卻至46 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約注入

15 mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使之混合均勻，同時將平板計數(shù)瓊脂傾入加有1 mL稀釋液的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。

1.4.4 培養(yǎng)及計數(shù)

待營養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（36±1）℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h，進行計數(shù)，選取菌落數(shù)在30～300的平板，計算平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源

樣品稱量引入不確定度及樣品稀釋引入的不確定為A類;重復(fù)性引入的不確定度為B類，不確定度具體來源見圖1。

2.2 不確定度評定

2.2.1 取樣引入的不確定度

用500 mL的量筒量取225 mL的0.85%的生理鹽水，加入到已裝有25 mL的樣品原液的500 mL的三角瓶中。根據(jù)JJG 196—2006常用玻璃儀器規(guī)定，500 mL量筒容量允許誤差為±2.5 mL，假定其為矩形分布，則標準不確定度和相對標準不確定度分別為：u（V1）==1.443 4;urel（V1）==0.006 4。

2.2.2 樣品稀釋過程中引入的不確定度

樣品以10倍梯度稀釋是通過1 mL加樣到

9 mL的稀釋液中進行的，根據(jù)JJG 196—2006常用玻璃儀器規(guī)定，1 mL刻度吸管的容量允許誤差為±0.015 mL，假定其為矩形分布，則標準不確定度為u（V2）==0.008 7，其相對不確定度為urel（V2）==0.008 7。根據(jù)JJG 196—2006常用玻璃儀器規(guī)定，10 mL刻度吸管容量允許誤差為±0.1 mL，其標準不確定度為u（V3）==0.057 7;其相對不確定度為urel（V3）==0.005 77。

2.2.3 重復(fù)性引入的不確定度

對同一個樣品的10份樣品原液，按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》

（GB 4789.2—2016）進行檢測，檢測結(jié)果見表1。由于微生物檢測數(shù)據(jù)相差很大，不能直接進行統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)處理見表1。根據(jù)表1，利用下面計算公式計算出重復(fù)性引入的不確定度為

u（X）==0.021 8，樣品的相對不確定度為urel（X）==0.009 8。

2.3 合成不確定度

2.3.1 相對合成標準不確定度為：

Urel==0.015 7，合成不確定度為U菌落=Urel=0.015 7×2.235 5=

0.035 1

2.3.2 計算擴展不確定度

取95%的置信水平，自由度為9，查t分布表得K=2.26，則擴展不確定度為：

U=K×U菌落=2.26×0.035 1=0.079 3。

當(dāng)檢測結(jié)果以平均值表示時，其取值區(qū)間分布于±0.079 3。

3 結(jié)論

以第1個測試樣品為例，測定結(jié)果的對數(shù)值為2.204 1，其取值區(qū)間在2.204 1±0.079 3，取反對數(shù)的樣品的取值區(qū)間為133～192 CFU/mL，基于本次測量方法所得到的不確定度，第一樣品菌落總數(shù)測定結(jié)果可估算為133～190 CFU/mL。由于微生物檢測中，檢驗結(jié)果的分散性較大，不屬于正態(tài)分布，檢驗結(jié)果必須轉(zhuǎn)化成對數(shù)形式，使其接近正態(tài)分布，便于建立數(shù)學(xué)模型進行計算。

參考文獻

[1]中國合格評定認可國家委員會.測量不確定度要求的實施指南：CNAS-GL05—2011[S].北京：中國標準出版社，2011.

[2]國際標準化組織.測試和校準實驗室能力的通用要求：ISO/IEC17025—2005[S].北京：中國標準出版社，2005.

[3]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.

[4]張鳳桐.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定方法的效果分析[J].中國保健營養(yǎng)，2020，30（25）：357.

[5]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定：GB 4789.2—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.