基于IKnife-REIMS技術(shù)對(duì)地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品習(xí)水麻羊產(chǎn)地溯源的研究

張 季，凌 蕾，盧 葉，楊 沙，王蘭蘭，向麗萍,

（1.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州遵義 563099；2.國家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，貴州遵義 563099）

習(xí)水麻羊，屬全國地方良種，貴州省遵義市習(xí)水縣為原產(chǎn)地，現(xiàn)已經(jīng)成為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]。它是我國一個(gè)重要的動(dòng)物遺傳基因資源，2009年經(jīng)國家畜禽遺傳資源委員會(huì)專家現(xiàn)場(chǎng)鑒定為國家級(jí)畜禽遺傳資源，2011年入選《中國畜禽遺傳資源志·羊志》[2]。

目前已經(jīng)發(fā)布了遵義市地方標(biāo)準(zhǔn)DB5203/T 29-2019《地理標(biāo)志產(chǎn)品習(xí)水麻羊》[3]，其中規(guī)定了貴州省遵義市習(xí)水縣現(xiàn)轄行政區(qū)域，品種為黔北麻羊。為了做大做強(qiáng)肉羊產(chǎn)業(yè)，當(dāng)?shù)卣推髽I(yè)結(jié)合習(xí)水麻羊優(yōu)良的品質(zhì)資源，開發(fā)特色羊產(chǎn)品，樹立品牌，滿足市場(chǎng)和消費(fèi)者的需求[4]。但是，目前市場(chǎng)上隨處可見其它產(chǎn)地或品種的羊肉以次充好，假冒正宗的習(xí)水麻羊，給政府監(jiān)管、消費(fèi)者和市場(chǎng)帶來了許多負(fù)面影響[5]。所以如何在習(xí)水麻羊養(yǎng)殖、加工、運(yùn)輸、銷售的關(guān)鍵環(huán)節(jié)快速地對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)地溯源，成為當(dāng)前迫切需要解決的一個(gè)難題。

目前，關(guān)于習(xí)水麻羊的產(chǎn)地溯源工作鮮有研究，其它不同樣品的此類研究方法繁多，例如蛋白檢測(cè)技術(shù)[6-7]、光譜檢測(cè)技術(shù)[8-10]、基因檢測(cè)技術(shù)[11-15]、同位素檢測(cè)技術(shù)[16-18]和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)[19-21]等。除此以外，例如分析各產(chǎn)地藏豬肉中的常見常量元素、微量元素及重金屬元素在含量上的差異作為產(chǎn)地溯源的有效指標(biāo)提供參考[22]。上述相關(guān)溯源方法需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，耗時(shí)較長，不能夠?qū)崿F(xiàn)快速高效、實(shí)時(shí)溯源和樣品量大的檢測(cè)需求。

2009年，ZoltanTakats教授等通過將高頻的手術(shù)刀與質(zhì)譜相連創(chuàng)建了電子手術(shù)刀（Iknife），使生物組織快速蒸發(fā)，產(chǎn)生大量組織源性信息的氣體分子進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。該項(xiàng)技術(shù)被命名為快速蒸發(fā)電離技術(shù)（REIMS），它是一種新興的原位電離技術(shù)，可以快速電離蒸發(fā)生物組織而無需樣品的制備。REIMS技術(shù)被應(yīng)用于食品研究領(lǐng)域，例如使用Iknife手術(shù)刀-快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜法在8～12 s內(nèi)獲取數(shù)據(jù)，用于魚肉造假的實(shí)時(shí)代謝組學(xué)分析方法[23]。區(qū)分生馬肉和生牛肉、烹飪好的馬肉和烹飪好的牛肉，只要馬肉的含量＞5%，REIMS也能實(shí)現(xiàn)很好的區(qū)分[24]，通過REIMS在10 s內(nèi)就可以很好的通過模型的構(gòu)建區(qū)分母豬肉、公豬肉以及因?yàn)闆]有閹割，而帶有膻味的公豬肉。這比傳統(tǒng)的鑒別方式速度快很多[25]，IKnife-REIMS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)對(duì)南極犬牙魚進(jìn)行樣品采集，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化法對(duì)脂質(zhì)組學(xué)輪廓進(jìn)行分析等[26]。

本研究基于飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，通過IKnife-REIMS對(duì)習(xí)水麻羊和其它產(chǎn)地羊肉新鮮樣品進(jìn)行原位電離分析，建立起了習(xí)水麻羊和其它產(chǎn)地羊肉的數(shù)據(jù)模型，使得習(xí)水麻羊能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)溯源，并通過軟件和數(shù)據(jù)庫鑒別出習(xí)水麻羊和其它產(chǎn)地羊肉的特征標(biāo)記物，為習(xí)水麻羊有效監(jiān)管和產(chǎn)品產(chǎn)地追溯提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 質(zhì)譜純，德國默克公司；亮氨酸腦啡肽（Leu-Enkaphalin） 美國沃特世公司；冷凍餃子盒食品級(jí)PP材質(zhì)，有密封蓋，尺寸為31 cm×23.5 cm×3.5 cm，每格尺寸為7 cm×3.5 cm，九陽廚具；本研究共收集可靠的62組羊肉樣品，樣品均由專人收集，確保產(chǎn)地準(zhǔn)確真實(shí)。供試樣品明細(xì)見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information sheet

原位電離源飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS REMIS Q-TOF） 美國Waters公司；高頻電子刀 德國愛博（erbe）公司產(chǎn)品；XY-201煙霧凈化器 深圳市星奕環(huán)?？萍加邢薰?；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器 美國Millipore公司；IKnife-REIMS采集羊肉樣品裝置圖見圖1。

圖1 REIMS采集羊肉樣品裝置圖Fig.1 Device for collecting mutton use REIMS

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品數(shù)據(jù)采集 羊肉樣品的切割長約（10 cm）、寬約（4 cm）、高約（8 mm）的片狀物，放置于冷凍餃子盒中保存，需要使用時(shí)置于冷藏室解凍，整齊地平鋪放置于錫箔紙上，采用erbe高頻電刀對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)切割采集。切割電壓選取了10～50 V，長度選取0.5～3 cm，深度選取0.2～1.0 cm，時(shí)間選取1～5 s，每份樣品重復(fù)采集10～15刀。

每測(cè)試約10～15份樣品或者發(fā)現(xiàn)基線噪音過大時(shí)，需清洗離子源、手術(shù)刀和連接管路，使采集樣品的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

1.2.2 檢測(cè)條件 原位電離源飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用Leu-Enkaphalin亮氨酸腦啡肽（m/z=554.2615）作為質(zhì)量數(shù)校正內(nèi)標(biāo)，以甲醇為輔助溶液，流速200 μL/min，電加熱探針溫度500 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍50～1200 m/z，掃描時(shí)間1.0 s，根據(jù)文獻(xiàn)和初步實(shí)驗(yàn)，脂肪酸和磷脂在負(fù)離子模式下比正離子模式更容易產(chǎn)生電離[27-28]，故本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子模式采集樣品。

1.3 數(shù)據(jù)處理

首先應(yīng)用LiveID軟件根據(jù)實(shí)際情況選取TIC閾值，根據(jù)羊肉的產(chǎn)地建立不同的4組分組，將不同產(chǎn)地羊肉采集數(shù)據(jù)上傳至各個(gè)分組，分別是習(xí)水麻羊、貴州羊、吉林羊和內(nèi)蒙古羊，采用參數(shù)：主成分為25個(gè)化合物，線性判別為3，未識(shí)別閾值為20%，建立主成分分析（PCA）結(jié)合線性判別分析（LDA）的模型，觀察不同分組下不同產(chǎn)地羊肉的聚類分析情況。

應(yīng)用Progenesis Bridge軟件對(duì)REIMS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分割，導(dǎo)入Progenesis QI軟件進(jìn)行峰提取和差異化分析，考察樣品的聚類情況。通過EZinfo軟件找尋VIP＞1的差異化合物，進(jìn)一步篩選并通過數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集條件的優(yōu)化結(jié)果

新鮮羊肉樣品的脂質(zhì)較多部分（表皮、皮下脂肪等）切割的信號(hào)響應(yīng)較低，且與所需實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相差較大，所以均只采集瘦肉組織部分。為了保證采集數(shù)據(jù)穩(wěn)定且有效，總離子流圖中各個(gè)數(shù)據(jù)峰強(qiáng)度應(yīng)不低于5×107，故通過對(duì)不同參數(shù)條件的反復(fù)測(cè)試，最終確定電壓設(shè)定為40 V，長度2 cm，切口深度0.5 cm，切割持續(xù)時(shí)間2～3 s為最優(yōu)采集條件。選取習(xí)水麻羊的里脊肉切割得到負(fù)離子模式下總離子流圖和質(zhì)譜圖示于圖2。

圖2 習(xí)水麻羊樣品在負(fù)模式下的總離子流圖和質(zhì)譜圖Fig.2 Total ion count chromatogram and mass spectrum of Xishui brown goat at negative model samples

2.2 聚類分析結(jié)果

多元統(tǒng)計(jì)分析被應(yīng)用于鑒別習(xí)水麻羊。通過Live ID軟件建立4組分組，分別是習(xí)水麻羊、內(nèi)蒙古羊、吉林羊和貴州羊（除習(xí)水），選擇主成分分析（PCA）和選取25個(gè)主成分的線性判別分析（LDA）模式建立模型圖，見圖3。由圖3可見，有一些重疊的點(diǎn)位于不同的兩組樣品之間，但是4組分組總體上都有著良好的聚類分離效果，能區(qū)別于其它分組。創(chuàng)建該模型是用于預(yù)測(cè)實(shí)時(shí)在線分析的結(jié)果。輸出驗(yàn)證報(bào)告包括了所有分組的數(shù)量和能識(shí)別的、未識(shí)別的數(shù)量。

圖3 不同羊肉REMIS數(shù)據(jù)PCA-LDA聚類分析三維圖Fig.3 Three-dimensional graph of PCA-LDA cluster analysis in the REMIS data of different mutton

2.3 識(shí)別模型驗(yàn)證

在Live ID軟件中對(duì)對(duì)習(xí)水麻羊、內(nèi)蒙古羊、吉林羊和貴州羊的62個(gè)樣品共709個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行總體交叉模型組間驗(yàn)證分析，隨機(jī)分為5組，任意挑選4組建立新的模型，該模型對(duì)剩余的1組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)5次，預(yù)測(cè)模型的測(cè)定精確度。識(shí)別率為97.32%，結(jié)果列于表2和圖4。

表2 模型交叉驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Results of cross validation in model

由于該模型的建立最終是為了鑒別生產(chǎn)環(huán)節(jié)、流通領(lǐng)域中習(xí)水麻羊的產(chǎn)地溯源，故實(shí)驗(yàn)人員在市場(chǎng)上隨機(jī)選取了正宗的習(xí)水麻羊樣品（未加入建立模型），通過Iknife-REIMS系統(tǒng)重復(fù)切割該樣品獲取數(shù)據(jù)，通過上述模型對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)驗(yàn)證分析，分析結(jié)果全部匹配為習(xí)水麻羊，見圖4；說明REIMS檢測(cè)技術(shù)結(jié)合Live ID軟件所建立的實(shí)時(shí)溯源分析模型對(duì)習(xí)水麻羊的產(chǎn)地溯源檢測(cè)初步確定為準(zhǔn)確可靠。

圖4 習(xí)水麻羊?qū)崟r(shí)驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Real-time identification of Xishui Brown Goat sample

2.4 特征標(biāo)記物的篩選與鑒別

除了使用REIMS快速對(duì)習(xí)水麻羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源外，找尋特征差異化合物對(duì)于習(xí)水麻羊產(chǎn)地溯源工作也至關(guān)重要。通過EZinfo軟件對(duì)習(xí)水麻羊與其它羊（內(nèi)蒙古羊、吉林羊和貴州羊的總和）進(jìn)行OPLSDA模型分析，見圖5；選取變量權(quán)重值（VIP）＞1、方差分析非參數(shù)檢驗(yàn)P值≤0.05條件下的標(biāo)記化合物，得到習(xí)水麻羊和其它羊差異分析Loadings圖，見圖6。

圖5 習(xí)水麻羊和其它羊鑒定成分得分圖Fig.5 Score plot of the identified compositions of XishuiBrown Goat and other sheep

圖6 習(xí)水麻羊和其它羊差異分析Loadings圖Fig.6 Loadings differential analysis for Xishui Brown Goat and other sheep

將Loadings圖中主要差異化合物運(yùn)用Progenesis QI軟件生成的豐度圖，例如質(zhì)荷比m/z為282.2512的化合物在習(xí)水麻羊和其它羊之間的豐度如圖7。

圖7 質(zhì)荷比為282.2512化合物的豐度圖Fig.7 Abundance diagram of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

將該質(zhì)荷比信息通過LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫中搜索鑒別得到可能的化合物信息如表3，可能的結(jié)構(gòu)式信息如圖8。

圖8 質(zhì)荷比為282.2512化合物的可能的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Possible structural formula of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

表3 質(zhì)荷比為282.2512化合物的可能的化合物信息Table 3 Possible compound information of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

同樣的方式通過LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫將剩余的化合物進(jìn)行匹配識(shí)別，按最大倍數(shù)變化（Max fold change）由大到小排序，選取變化大的標(biāo)記物通過LIPID MAPS?Lipidomics Gateway網(wǎng)站進(jìn)行信息匹配，共計(jì)篩選出16個(gè)差異較大的特征標(biāo)記物，見表4。

表4 習(xí)水麻羊和其它羊的特征標(biāo)記化合物Table 4 Characteristic marker compounds between Xishui brown goat and other sheep

表4顯示了習(xí)水麻羊和其它羊通過REIMS切割得到的質(zhì)荷比（m/z）在50～1200范圍內(nèi)的特征標(biāo)記化合物，總共有16個(gè)化合物作為兩者之間的差異較大化合物。REIMS作為一個(gè)相對(duì)高能量的過程，分別誘導(dǎo)磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的去甲基化（[M-CH3]-）和脫氨基（[M-NH3]-）。例如質(zhì)荷比（m/z）為282.2512和280.2402的離子峰可能產(chǎn)生于羧酸根陰離子分別為[R18:2COO]-和[R18:1COO]-的游離脂肪酸（m/z=721.5258的離子峰）。其它羊的特征標(biāo)記物主要集中在質(zhì)荷比（m/z）大于700的磷脂一類化合物，其中，鞘氨醇（m/z=721.5258）和磷脂酰肌醇（m/z=866.5884）為主要離子峰；習(xí)水麻羊的特征標(biāo)記物主要集中在質(zhì)荷比（m/z）＜430的小分子脂肪酸一類化合物，其中，十七碳二烯酸（m/z=280.2402）和二十碳二烯酸（m/z=304.2402）為主要離子峰。習(xí)水麻羊中琥珀酸作為特征標(biāo)記化合物區(qū)別于其它羊，可能是由于貴州良好的山地自然資源與習(xí)水麻羊放牧式喂養(yǎng)，促使習(xí)水麻羊食用天然含有琥珀酸的植物，因?yàn)殓晁釋儆诙替溨舅幔ㄌ荚樱?），天然來源是松屬植物的樹脂久埋于地下而成的琥珀或多種植物組織中。通常飛行時(shí)間質(zhì)譜儀用于定性分析，定量分析不及三重四級(jí)桿質(zhì)譜，鑒定出的化合物需要進(jìn)一步通過購置相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用三重四級(jí)桿用于定量分析，得到準(zhǔn)確結(jié)果，這樣不僅能找出習(xí)水麻羊和其它產(chǎn)地羊之間的差異化合物，還能夠分析它們的含量高低，為進(jìn)一步研究習(xí)水麻羊中的內(nèi)含成分提供理論支撐。

3 討論與結(jié)論

本研究依托原位電離源-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和Live ID等軟件，建立了一種對(duì)習(xí)水麻羊產(chǎn)地溯源的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法不需要對(duì)羊肉樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理工作，通過前期數(shù)據(jù)采集建立模型就能對(duì)未知羊肉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)產(chǎn)地溯源工作，且分析時(shí)間縮短至數(shù)秒，不過該技術(shù)需要收集大量的真實(shí)樣品用于建模，所以將來會(huì)不斷采集不同年齡、不同部位、不同養(yǎng)殖場(chǎng)的習(xí)水麻羊來完善該模型。

另外，通過Progenesis QI、EZinfo等軟件對(duì)羊肉樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選并鑒定一系列特征標(biāo)記物，這為將來利用特征標(biāo)記物進(jìn)一步鑒別習(xí)水麻羊提供前期理論基礎(chǔ)，同時(shí)，篩選特征且有益的化合物對(duì)于習(xí)水麻羊的產(chǎn)品力競(jìng)爭(zhēng)、銷售也有著積極的推廣作用。