小魚際法對骨骼肌鈍性損傷家兔生長分化因子8與F-肌動蛋白的影響

陳海南 盧園 楊舟 孫夢龍 王蘭蘭 薛惠天 彭亮

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18只3月齡的新西蘭大耳白兔，雌雄各半，體質(zhì)量范圍為252.41～320.67克，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)研究所實驗動物中心提供[動物許可證號：SYXK(湘)2015-0008]。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定在20～25℃，濕度保持50%～70%。

1.2 試劑與儀器

蛋白磷酸酶抑制劑(北京普利萊)，蛋白酶抑制劑(北京金泰宏達)，標(biāo)準電泳裝置(北京六一)，ZTC-II按摩手法測試儀(上海騰蔭教學(xué)儀器有限公司)，石蠟切片機(浙江金華)，TGF-β1、IL-6試劑盒(武漢華美，批號：C0358190399、G19035853)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京永光明)，全自動酶標(biāo)洗板機與分析儀(深圳匯松科技)。

1.3 動物分組與造模

根據(jù)文獻[10]中的改進方法，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，使用自制重錘擊打家兔右后肢以建立股四頭肌損傷模型。模型具體制備過程：將兔腹部朝上固定于實驗臺，選取右后肢的股四頭肌肌腹中部為圓心，畫一直徑1 cm的圓圈標(biāo)記擊打處，并覆蓋一層紗布防止擊打過程中造成表皮損傷。專人使用特制重錘(質(zhì)量850 g，用于擊打的錘面為光滑木質(zhì)圓柱，直徑1.5 cm)從40 cm高處沿光滑不銹鋼管以自由落體方式下落擊打標(biāo)記的受擊處，連續(xù)擊打6次。測算求得每次擊打的動能為3.33 J，沖量為2.38 Ns，擊打面積約為1.77 cm2。擊打過程中有專人以手固定兔腿部，防止因家兔掙扎移動導(dǎo)致?lián)舸虿课黄苹蛟斐善渌鈧?。造模成功?biāo)準為肉眼觀察受擊處有明顯的淤血腫脹，且無明顯皮膚損傷與骨折，以手輕觸時家兔有明顯的逃避反射。滿足上述條件認定造模成功，將造模成功兔放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.4 小魚際法治療

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 取材 造模后第8天，采用耳緣靜脈注射空氣處死動物，保證取材過程中的無菌環(huán)境后暴露分離股四頭肌，切取損傷最為嚴重的骨骼肌組織用于后續(xù)檢測。

1.5.2 骨骼肌組織形態(tài)學(xué)觀察 切取適量受損最嚴重部位的骨骼肌組織，進行常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，隨后進行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，染色后以中性樹膠封片，置于顯微鏡下進行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.3 Western Blot法檢測骨骼肌組織GDF-8與F-肌動蛋白的表達 剪取0.03 g受損最嚴重部位的骨骼肌組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，剪碎后放入生物樣品均質(zhì)儀，并向其中加入400 μL RIPA裂解液，反復(fù)研磨直至肉眼無法觀測到組織塊，冰上裂解10分鐘后，置于已經(jīng)預(yù)冷的離心機上，在4℃下以12 000 r/min離心15分鐘，提取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，后經(jīng)過制膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯色曝光，檢測骨骼肌中GDF-8和F-肌動蛋白表達量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，重復(fù)3次。

1.5.4 ELISA法檢測骨骼肌組織TGF-β1與IL-6的表達 剪取適量受損最嚴重部位的骨骼肌組織，用1×PBS洗去血污并置于組織研磨器中制成組織勻漿，-20℃保存一晚后經(jīng)2次凍融處理破壞細胞膜，后將組織勻漿置于2～8℃以5 000 g轉(zhuǎn)速離心5分鐘，提取上清液。試劑盒于低溫取出后置于室溫至少30分鐘，并通過離心、稀釋、溶解、吹打混勻等步驟配置。在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小魚際法對骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織病理學(xué)的影響

骨骼肌組織HE染色結(jié)果可見，空白組肌細胞分布緊密，無明顯間隙；模型組大量肌細胞破損變形，細胞間隙相比空白組顯著增大，細胞間大量肌纖維、瘢痕形成；治療組細胞間隙相比于模型組更小，細胞間纖維組織較少，細胞形態(tài)更接近健康肌細胞。見圖1。

注：A、B 空白組；C、D 模型組；E、F 治療組。

2.2 小魚際法對骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織GDF-8、F-肌動蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組與治療組GDF-8表達量都出現(xiàn)顯著上升，同時治療組GDF-8表達水平顯著低于模型組。與空白組相比，模型組與治療組F-肌動蛋白表達量都出現(xiàn)顯著上升，同時治療組F-肌動蛋白表達水平顯著低于模型組。上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

注：1、4 空白組；2、5 模型組；3、6治療組。

表1 小魚際法對骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織GDF-8、F-肌動蛋白表達的影響

2.3 小魚際法對骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織TGF-β1、IL-6表達的影響

模型組TGF-β1表達量相比于空白組有明顯上升，治療組TGF-β1表達量相比于模型組又有進一步提升。模型組、治療組IL-6的表達量相比于空白組均出現(xiàn)明顯上升，但治療組相比于模型組則出現(xiàn)了明顯的下降。上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 小魚際法對骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織TGF-β1、IL-6表達的影響

3 討論

生理學(xué)實驗觀察證明，當(dāng)骨骼肌嚴重損傷時，需要先通過中性粒細胞與巨噬細胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)清除壞死組織，而后周邊正常肌肉組織開始分裂增生以修復(fù)損壞肌肉[12]。正常肌肉組織的增生依賴于肌膜的完整性與附著于其上肌核的存活，而當(dāng)損傷過于嚴重時，過多壞死組織會使得機體不得不依賴長時間的炎癥反應(yīng)來清理患處。這會損傷周邊組織，造成肌肉組織的增生能力下降。此時結(jié)締組織修復(fù)會占據(jù)主導(dǎo)，損傷部位會被填充大量纖維化結(jié)締組織，從而形成瘢痕，造成肌肉彈性與收縮能力下降。因此加快正常肌肉組織的再生速度，減緩肌肉纖維化與損傷后的炎癥反應(yīng)是保障損傷后肌肉運動功能恢復(fù)的關(guān)鍵[13-14]。

GDF-8是一種能夠抑制肌肉生長的蛋白質(zhì)，最早由遺傳學(xué)家McPherron和Se-Jin Lee于1997年發(fā)現(xiàn)[15]。研究證實這一物質(zhì)能有效抑制肌肉的生長與肌肉量，而缺乏GDF-8的動物個體，在保證營養(yǎng)的前提下即使不經(jīng)過鍛煉，肌肉生長速度與肌肉量也顯著高于同類正常個體。F-肌動蛋白則在早期已被證明是一種參與肌肉組織修復(fù)與肌肉運動功能的重要蛋白質(zhì)。在肌肉損傷恢復(fù)過程中，眾多研究表明TGF-β1是抑制炎癥反應(yīng)的一種重要生理因子[16-18]，而IL-6則是一種重要的促炎因子，在外傷、手術(shù)等情況時其表達水平往往會急劇升高，引發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)[19]。目前從GDF-8與F-肌動蛋白這兩項指標(biāo)探討推拿治療骨骼肌損傷與抑制炎癥反應(yīng)的內(nèi)在機理研究較少，故而揭示推拿治療骨骼肌損傷、抑制炎癥反應(yīng)與GDF-8和F-肌動蛋白這兩項指標(biāo)之間的關(guān)系，可以為推拿治療骨骼肌損傷提供多角度的生理學(xué)依據(jù)，也可以為后續(xù)的臨床改良與深入實驗研究提供新思路與方向。