榮筋拈痛方對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的體外大鼠軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

潘丹虹 李路 王文義 林晴 付長(zhǎng)龍 吳廣文 葉錦霞

【摘 要】目的：觀察榮筋拈痛方對(duì)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的體外大鼠軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其防治膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：取4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)行軟骨細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，選取第2代軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。經(jīng)IL-1β 10 ng·mL-1誘導(dǎo)建立體外軟骨細(xì)胞炎癥模型，誘導(dǎo)成功后，給予榮筋拈痛方（50，100，200 μg·mL-1）孵育48 h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，榮筋拈痛方低、中、高劑量組。分別采用CCK-8法檢測(cè)榮筋拈痛方對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響，qPCR法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表達(dá)，Western Blot法觀察自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin 1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方低、中、高劑量組均顯著提高細(xì)胞活力，呈劑量依賴性增加（P < 0.01）;模型對(duì)照組較空白對(duì)照組LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達(dá)水平升高（P < 0.05）;經(jīng)100 μg·mL-1榮筋拈痛方干預(yù)后LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05）。結(jié)論：榮筋拈痛方可能通過抑制自噬水平，從而具有延緩膝骨關(guān)節(jié)炎退變的作用。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎;榮筋拈痛方;軟骨細(xì)胞;自噬;白細(xì)胞介素-1β;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）on theexpression of autophagy related gene of interleukin-1β-induced rat chondrocytes in vitro and its mechanism in the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：The knee cartilages of 4-week-old SD rats were isolated and cultured in vitro.The second-generation chondrocytes were stained with toluidine blue for cell identification.Via IL-1β 10 ng·mL-1，The chondrocyte inflammation model in vitro was induced.After successful induction，Rongjin Niantong Fang（50，100，200 μg·mL-1）was used for incubation for 48 h.The cells were divided into a blank control group，a model group and the low，medium and high dose groups.The effect of Rongjin Niantong Fang on chondrocyte activity was detected by the CCK-8 method;The mRNA expressions of LC3Ⅱ and Beclin 1 in chondrocytes were detected by qPCR;The ratio of autophagy protein LC3Ⅱ/Ⅰ and the protein expression level of Beclin 1 were observed by Western Blot.Results：Compared with the model control group，the cell viability in the low，medium and high dose groups of Rongjin Niantong Fang significantly increased in a dose-dependent manner（P < 0.01）;The mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 in the model control group were higher than those in the blank control group（P < 0.05）;After the intervention of Rongjin Niantong Fang（100 μg·mL-1），the mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression levels of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 decreased（P < 0.05）.Conclusion：Rongjin Niantong Fang may delay the degeneration of knee osteoarthritis by inhibiting the level of autophagy.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）;chondrocytes;autophagy;interleukin-1β;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變和關(guān)節(jié)炎癥為特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病[1]，多見于中老年人，年齡≥60歲的人群中約有80%的人出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）[2]。自噬是細(xì)胞生存、分化和發(fā)育必不可少的途徑，在炎癥反應(yīng)中具有雙向調(diào)節(jié)作用，在促進(jìn)和抑制炎癥反應(yīng)方面同等重要。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）被普遍認(rèn)為是引起關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的主要促炎癥細(xì)胞因子，常作為OA體外退變軟骨細(xì)胞模型誘導(dǎo)劑。前期研究表明，榮筋拈痛方具有多靶點(diǎn)成分，臨床防治KOA效果明顯[3-5]。因此，本研究選用榮筋拈痛方作為干預(yù)媒介，以體外退變軟骨細(xì)胞作為研究載體，觀察榮筋拈痛方對(duì)退變軟骨細(xì)胞自噬的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取1月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量90～100 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 榮筋拈痛方由牛膝、當(dāng)歸、羌活等藥物組成。榮筋拈痛方凍干粉由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，采用純水回流提取法，常溫浸泡30 min，加熱冷凝回流1.5 h，重復(fù)3次提取收集湯藥，在冷凍機(jī)低溫干燥24 h制備成榮筋拈痛方凍干粉。其安全性及質(zhì)量控制均已經(jīng)完成鑒定，以確保成分均一性、穩(wěn)定性和有效性，符合用藥標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 IL-1β（美國Sigma公司，批號(hào)MKCL5731）;LC3B、Beclin 1、GAPDH引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成;LC3A/B一抗（美國CST公司，批號(hào)4）;Beclin 1一抗（美國Abcam公司，批號(hào)GR3254931-2）;GAPDH一抗（美國Abcam公司，批號(hào)GR3316865-9）;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司，批號(hào)AJ11541A）;TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司，批號(hào)AK31128A）;DMIL/DFC295倒置顯微鏡（德國Leica公司）;ND-2000C超微量核酸分析儀（美國Thermo公司）;CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）;逆轉(zhuǎn)錄儀（德國 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 參照課題組前期基礎(chǔ)[6-7]，2只SD大鼠經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥麻醉后脫頸處死，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的無水乙醇浸泡5 min，摘取其雙側(cè)膝關(guān)節(jié)純水沖洗后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的無水乙醇浸泡數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)操作：先用PBS漂洗3遍，提取的軟骨碎片置入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶的藍(lán)蓋瓶于37 ℃，100 r·min-1水浴搖床消化，每小時(shí)吸取1次上清液，120目尼龍網(wǎng)篩過濾，所得濾液置于離心機(jī)，離心半徑12.29 cm，以1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，收集軟骨細(xì)胞沉淀，重復(fù)3次;用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的低糖DMEM于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)，消化培養(yǎng)得到穩(wěn)定且狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞，采用甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定;第2代軟骨細(xì)胞爬片長(zhǎng)至90%后，棄舊培養(yǎng)液，加入無菌PBS輕柔沖洗3遍;加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛并在室溫下進(jìn)行固定，30 min后棄固定液，無菌PBS沖洗3遍;棄無菌PBS溶液，每張載玻片加0.2 mL細(xì)胞專用甲苯胺藍(lán)染色液，室溫孵育30 min，蒸餾水洗凈，室溫晾干，中性樹脂封片后光學(xué)顯微鏡下觀察記錄。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將第2代軟骨細(xì)胞懸液以1×105·mL-1的密度接種于6孔板，隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，榮筋拈痛方低、中、高劑量組?？瞻讓?duì)照組：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS + 低糖DMEM。模型對(duì)照組：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS + 低糖DMEM，經(jīng)10 ng·mL-1 IL-1β（DMEM完全培養(yǎng)基配制）誘導(dǎo)24 h。榮筋拈痛方低、中、高劑量組：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS + 低糖DMEM，經(jīng)10 ng·mL-1 IL-1β誘導(dǎo)24 h后，吸棄培養(yǎng)液換成50，100，200 μg·mL-1不同濃度的榮筋拈痛方再干預(yù)48 h。

2.3 CCK-8法檢測(cè)榮筋拈痛方對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響 將消化重懸后的軟骨細(xì)胞以5×104·mL-1的密度，按每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)貼壁培養(yǎng)24 h;每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，經(jīng)10 ng·mL-1 IL-1β誘導(dǎo)24 h;棄培養(yǎng)液，換成50，100，200 μg·mL-1不同濃度的榮筋拈痛方再干預(yù)48 h;避光條件下每孔加入10 μL CCK-8試劑置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，用酶標(biāo)儀震蕩30 s，450 nm讀取OD值。

2.4 q-PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表達(dá) 用Trizol法分離提取各組的總RNA，濃度測(cè)定后，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒操作步驟依次進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到相應(yīng)組別的cDNA;接著按TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑說明書建立PCR體系，以95℃ 30 s、95℃ 3 s、60℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)、Melt Curve Stage為體系，使用CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)。使用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)使用的正向、反向引物序列，見表1。采用?2???Cq方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 Western Blot法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達(dá) 將各組總蛋白提取后，進(jìn)行定量、變性。隨后配膠，每孔20 μL上樣后，按20 V 10 min、80 V 30 min、110 V 60 min條件進(jìn)行電泳;用激活的PVDF膜轉(zhuǎn)膜后室溫?fù)u床封閉1 h，4?C搖床孵育一抗GAPDH（1∶10000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1000）、Beclin 1（1∶2000）過夜;TBST蕩洗后室溫?fù)u床孵育二抗1 h，隨后滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影操作，最后Image Lab分析條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布采用One-way ANOVA方差分析，方差齊組間比較采用LSD法，方差不齊則采用Games-Howell法;不符合正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis Test非參數(shù)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各代軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察 原代軟骨細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化，差數(shù)貼壁純化培養(yǎng)，倒置顯微鏡鏡下可見：原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)1 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞成簇成團(tuán)貼壁向周圍生長(zhǎng)，見圖1（1）。原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)8 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)為圓形和橢圓形，見圖1（2）。原代細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)為第1代軟骨細(xì)胞時(shí)，傳代后雜質(zhì)細(xì)胞減少，生長(zhǎng)速度加快，貼壁時(shí)間縮短，約5 d可以鋪滿皿底，見圖1（3）。第2代軟骨細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，以圓形及橢圓形為主，胞核清晰，胞漿豐富，邊緣清晰，呈典型的“鋪路石”狀，第2代軟骨細(xì)胞分裂迅速和第1代軟骨細(xì)胞相比又有所提升，約3 d鋪滿皿底，見圖1（4）。因后續(xù)傳代培養(yǎng)的第3代[見圖1（5）]、第4代[見圖1（6）]軟骨細(xì)胞經(jīng)傳代部分會(huì)分化為肥大細(xì)胞，生長(zhǎng)速度減慢且細(xì)胞形態(tài)邊界不清，故選擇細(xì)胞生長(zhǎng)速度快、形態(tài)最佳的第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果 選擇第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。甲苯胺藍(lán)染色后軟骨細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)深藍(lán)色，胞核呈紫色，細(xì)胞整體呈藍(lán)紫色。見圖2。

3.3 CCK-8法檢測(cè)榮筋拈痛方對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的細(xì)胞活力顯著降低（P < 0.01），而與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方低、中、高劑量組細(xì)胞活力均顯著提高，呈劑量依賴性增加（P < 0.01）。見表2。

3.4 各組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表達(dá)情況 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表達(dá)水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方中、高劑量組LC3Ⅱ的mRNA表達(dá)水平降低（P < 0.01），榮筋拈痛方低、中、高劑量組Beclin 1的mRNA表達(dá)水平降低（P < 0.01）。見表3。

3.5 各組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達(dá)水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方中、高劑量組LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05或P < 0.01），榮筋拈痛方低、中、高劑量組Beclin 1的蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05）。見圖3、表4。

4 討 論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”或“歷節(jié)風(fēng)”等范疇，《素問·痹論篇》最早提出“骨痹”這一概念，并認(rèn)為是風(fēng)寒濕三氣夾雜侵襲人體所致。OA病因病機(jī)總屬“本痿標(biāo)痹”，其本為肝腎虧虛，標(biāo)為風(fēng)寒濕邪入侵、瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)。故中醫(yī)辨證多從風(fēng)寒濕論治、從肝腎論治及從痰瘀論治[8]，臨床常用方劑有當(dāng)歸四逆湯[9]、獨(dú)活寄生湯[10]、榮筋拈痛方及身痛逐瘀湯[11]等。榮筋拈痛方的補(bǔ)肝腎、壯筋骨、祛風(fēng)濕和止痹痛功效符合OA痹證日久肝腎兩虛的核心病機(jī)，是在國醫(yī)大師陳可冀院士指導(dǎo)下擬出的治療OA的新組方。該方由牛膝、當(dāng)歸、羌活等藥物組成，治療OA的總有效率、疼痛評(píng)分以及癥狀積分下降程度與對(duì)照組獨(dú)活寄生湯比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），療效相當(dāng)[12]，該方制備方法和用途已獲國家發(fā)明專利授權(quán)[ZL201710284659.8]。鄭春松等[3，13]運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬探索榮筋拈痛方治療OA作用靶點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其作用靶點(diǎn)有基質(zhì)金屬蛋白酶-1、IL-1β和腫瘤壞死因子-α，可以通過抑制炎癥、抑制分解代謝和刺激合成代謝等方面保護(hù)軟骨，緩解疼痛。林潔等[5]結(jié)合BATMAN-TCM預(yù)測(cè)分析榮筋拈痛方對(duì)OA的作用及靶點(diǎn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證榮筋拈痛方能夠治療OA。

自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞對(duì)各種壓力的反應(yīng)，細(xì)胞器和大分子被吞噬分解參與體內(nèi)循環(huán)以維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)，即細(xì)胞的“自我吞噬”過程[14]。自噬又是一把“雙刃劍”，可能在軟骨細(xì)胞中同時(shí)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)死亡的作用[15]。而這可能取決于細(xì)胞應(yīng)激的類型，當(dāng)在炎癥[16]、缺氧[17]等條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡，自噬也被報(bào)道在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激下細(xì)胞發(fā)揮存活作用[18]。但同時(shí)又有研究表明，自噬是有益還是有害取決于炎癥、氧化應(yīng)激[19]等刺激的程度和持續(xù)時(shí)間[20]。故保持高水平的自噬可能發(fā)揮對(duì)軟骨的保護(hù)作用;但在某些條件下，過度自噬卻可能造成軟骨細(xì)胞的損傷，誘發(fā)或加重KOA。

在自噬激活的過程中，Beclin1和LC3是自噬激活的可靠生物標(biāo)記物，其中Beclin1是酵母自噬基因Atg/Vps30的同源基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬的激活密切相關(guān)，Beclin1表達(dá)上調(diào)是自噬過程激活的必要條件[21]。LC3是Atg8蛋白的一個(gè)同源體，也是目前研究最廣泛的一個(gè)自噬標(biāo)記蛋白。LC3蛋白的主要功能是磷脂化，在細(xì)胞中有兩種剪切類型，即LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅰ主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，LC3Ⅱ則主要定位在自噬小體膜結(jié)構(gòu)上。當(dāng)自噬形成時(shí)，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ，并與自噬小泡結(jié)合，故LC3Ⅱ數(shù)量與自噬形成的程度呈正相關(guān)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率通常用于評(píng)估自噬水平[22]。Beclin1表達(dá)與自噬體的形成和成熟有關(guān)，與自噬水平呈正相關(guān)，是自噬的正向調(diào)節(jié)因子。本研究檢測(cè)了大鼠軟骨細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，結(jié)果顯示，在10 ng·mL-1 IL-1β刺激24 h后，模型對(duì)照組自噬水平明顯增加;而給予榮筋拈痛方干預(yù)后，自噬水平顯著下降。提示IL-1β的炎癥刺激可增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);而榮筋拈痛方可能是通過抑制自噬水平，使自噬恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡，從而達(dá)到改善軟骨細(xì)胞炎癥情況。

綜上所述，100 μg·mL-1榮筋拈痛方對(duì)于緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞過度自噬效果顯著，榮筋拈痛方可以抑制KOA的進(jìn)展，其機(jī)制可能與自噬有關(guān)。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，未來的研究可通過檢測(cè)榮筋拈痛方對(duì)不同KOA階段軟骨細(xì)胞自噬水平的影響，進(jìn)一步闡明榮筋拈痛方的抗KOA機(jī)制，為KOA的防治提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2021-10-16;修回日期：2021-12-08