殺蟲(chóng)劑阿維菌素、伊維菌素對(duì)斜生柵藻和大型蚤的毒性作用

陳彥吉，柳川江，宋怡彤，林以詩(shī)，徐冬梅

浙江樹(shù)人學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015

阿維菌素(avermectin, AVM)是一類具有殺菌、殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物。作為甲胺磷等高毒農(nóng)藥的替代品，AVM由于具有殺蟲(chóng)范圍廣、效果明顯持久且相對(duì)安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，順應(yīng)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)農(nóng)藥的要求，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用[1-2]。其衍生物伊維菌素(ivermectin, IVM)對(duì)寄生蟲(chóng)特別是線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有較好的防治效果，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的害蟲(chóng)防治劑[3]。AVM和IVM是高脂溶性的，不論以何種途徑給藥，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后殘留時(shí)間長(zhǎng)且代謝很少，大部分是以原藥的形式經(jīng)糞尿排出體外[4]。因此，該類藥物除在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中通過(guò)直接噴灑進(jìn)入環(huán)境外，還可能隨畜禽類生物的代謝物進(jìn)入水體環(huán)境[5-6]，其對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。該類藥物還可能通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷和AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬產(chǎn)生遺傳毒性和細(xì)胞毒性，從而對(duì)人類健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)[7]。

大型蚤(Daphniamagna)為甲殼綱的枝角類浮游動(dòng)物，廣泛分布于淡水水域。它以水環(huán)境初級(jí)生產(chǎn)者淡水綠藻類為食，同時(shí)又是魚(yú)和無(wú)脊椎捕食動(dòng)物的天然餌料，是水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)[8]。作為靜水生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵屬，大型蚤不僅具有重要的生態(tài)意義，而且具有生殖周期短、繁殖迅速、對(duì)水體中有害污染物敏感等特點(diǎn)，在水生生態(tài)毒理學(xué)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。本研究以水生態(tài)初級(jí)生產(chǎn)者淡水綠藻和浮游動(dòng)物大型蚤為模式生物，在考察AVM和IVM對(duì)斜生柵藻和大型蚤急性毒性的基礎(chǔ)上，探討2種殺蟲(chóng)劑對(duì)大型蚤生長(zhǎng)繁殖等的影響，為評(píng)價(jià)AVM、IVM對(duì)水生態(tài)環(huán)境的影響及可能的健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，以水生4號(hào)(HB-IV)培養(yǎng)基、人工氣候箱中馴養(yǎng)1個(gè)月后進(jìn)行試驗(yàn)。大型蚤購(gòu)自武漢科樂(lè)多生物科技有限公司，選用OECD M4培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)4代后，以出生6～24 h的同批幼蚤進(jìn)行毒性試驗(yàn)。AVM和IVM原藥購(gòu)自湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司，試驗(yàn)所用其余試劑均為分析純(純度均為99%)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻接種到150 mL錐形瓶中，實(shí)驗(yàn)初始藻細(xì)胞密度約7.0×105個(gè)·mL-1，總體積100 mL。設(shè)置AVM和IVM的試驗(yàn)濃度梯度均為0、20、40、80、160、320和640 mg·L-1。每個(gè)試驗(yàn)濃度組設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)期間保持光暗比12 h∶12 h，光照強(qiáng)度4 500～5 000 lx，培養(yǎng)溫度(24±1) ℃[11]。藥物暴露96 h后用血球計(jì)數(shù)法計(jì)量細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算AVM和IVM對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。大型蚤急性毒性試驗(yàn)按照ISO 6341—2012標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行[12]。試驗(yàn)容器為50 mL燒杯，盛40 mL試驗(yàn)溶液，每個(gè)燒杯中放5只幼蚤，AVM和IVM的大型蚤暴露濃度均設(shè)置為0、0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 μg·L-1，水溫20～22 °C，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗，試驗(yàn)期間不喂食，每個(gè)濃度4組平行，連續(xù)暴露48 h后，記錄大型蚤的死亡情況，計(jì)算AVM和IVM對(duì)大型蚤半數(shù)致死濃度(LC50)值。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)求得的2種藥物對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50值，慢性試驗(yàn)的AVM、IVM濃度設(shè)置分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg·L-1和0.0038、0.0075、0.015、0.03、0.06 μg·L-1，慢性毒性試驗(yàn)參照楊曉凡等[13]的方法。每個(gè)燒杯中放1只幼蚤，每濃度設(shè)置10個(gè)平行，染毒過(guò)程中保證蚤類的生活環(huán)境適宜和食物充足，并且每天定時(shí)觀察、記錄和分離幼蚤，每3 d更換一次培養(yǎng)液，其余條件與急性毒性試驗(yàn)相同。

利用Origin 8.0軟件進(jìn)行斜生柵藻急性毒性劑量效應(yīng)曲線的擬合，利用SPSS 17.0軟件計(jì)算AVM和IVM對(duì)大型蚤的LC50值及95%置信區(qū)間；通過(guò)Duncan法進(jìn)行組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用means±SD的方法。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 AVM和IVM對(duì)斜生柵藻的毒性作用

利用非線性最小二乘擬合(NLSF)模塊下的DoseResp模型對(duì)斜生柵藻96 h生長(zhǎng)抑制結(jié)果進(jìn)行線性擬合，進(jìn)而求得AVM和IVM對(duì)藻生長(zhǎng)抑制率的濃度-效應(yīng)曲線(圖1)。由圖1可知，20～160 mg·L-1的2種農(nóng)藥暴露下，斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制曲線變化較為平緩；藥物濃度增至320 mg·L-1后，AVM對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著增大，并且遠(yuǎn)高于相同濃度IVM的抑制率；至最高濃度640 mg·L-1，AVM和IVM對(duì)斜生柵藻的抑制率分別達(dá)55.73%和41.84%。表明AVM對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制作用較IVM更強(qiáng)。

圖1 阿維菌素(AVM)和伊維菌素(IVM)暴露的斜生柵藻急性毒性劑量效應(yīng)曲線Fig. 1 Dose-response curves of acute toxicity of Scenedesmus obliquus exposed to avermectin (AVM) and ivermectin (IVM)

目前的研究證明，AVM類藥物對(duì)植物的毒性作用遠(yuǎn)小于非靶標(biāo)動(dòng)物。Ti?ler和Er?en[6]通過(guò)21 d暴露實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)AVM對(duì)水環(huán)境大型蚤的生存和繁殖具有極高的毒性，而淡水綠藻(Scenedesmussubspicatus)對(duì)AVM的響應(yīng)并不敏感，20 mg·L-1的AVM對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到100%。本研究640 mg·L-1的AVM和IVM對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制率為50%左右，可見(jiàn)2種藥物對(duì)淡水綠藻的生長(zhǎng)抑制作用并不明顯。但張衛(wèi)衛(wèi)等[14]研究發(fā)現(xiàn)植物伊樂(lè)藻(Elodeanuttallii)對(duì)于AVM具有明顯的吸收和富集作用。經(jīng)AVM淋溶后的土壤淋出液會(huì)造成浮萍(LemnaminorL.)葉綠素含量降低[15]。在群落水平上，AVM類藥物短期暴露可顯著影響水體浮游植物群落結(jié)構(gòu)。向主養(yǎng)草魚(yú)的池塘中施用AVM 6 d后，水體浮游植物優(yōu)勢(shì)種變化顯著，小型浮游植物種類增多[16]。此外，Macar[17]報(bào)道了AVM對(duì)洋蔥鱗莖具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性，表現(xiàn)為經(jīng)AVM暴露的細(xì)胞有絲分裂指數(shù)下降、染色體異常，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性和丙二醛含量等氧化應(yīng)激指示升高。而Muhammad等[18]通過(guò)系統(tǒng)分析AVM噴灑水稻后其轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)施藥情況下水稻突變的基因數(shù)量為0.91%，表明其對(duì)水稻生產(chǎn)性能影響不明顯。

2.2 AVM和IVM對(duì)大型蚤的急性毒性

由圖2可知2種藥物對(duì)大型蚤48 h急性毒性影響，在0.1～6.4 μg·L-1的藥物作用濃度范圍內(nèi)，IVM對(duì)大型蚤的致死作用始終大于AVM，至最高濃度25.6 μg·L-1時(shí)，2種藥物暴露的大型蚤死亡率均達(dá)到100%。計(jì)算得到AVM和IVM 48 h急性毒性LC50值分別為1.43 μg·L-1和0.5 μg·L-1，相應(yīng)的95%置信區(qū)間為0.76～2.74 μg·L-1和0.23～0.96 μg·L-1(表1)。根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則中農(nóng)藥對(duì)大型甲殼類生物急性毒性劃分標(biāo)準(zhǔn)，AVM和IVM對(duì)大型蚤均為劇毒(LC50-48h值遠(yuǎn)小于0.1 mg·L-1)[19]，且IVM對(duì)大型蚤的急性致死作用較AVM更強(qiáng)。

圖2 AVM和IVM對(duì)大型蚤的急性致死作用Fig. 2 Acute lethal effects of AVM and IVM on Daphnia magna

表1 AVM和IVM對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50-48h及置信區(qū)間Table 1 LC50-48h and confidence interval of AVM and IVM for Daphnia magna

與對(duì)植物的毒性影響不同的是，AVM類藥物對(duì)水生動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性作用[6, 20]。王錫珍和陸宏達(dá)[21]采用換液法求得AVM對(duì)大型蚤的LC50-48h為0.37 μg·L-1，AVM對(duì)供試淡水水生動(dòng)物的毒性依次為：大型蚤>異育銀鯽魚(yú)苗>鰱魚(yú)苗>異育銀鯽魚(yú)種>食蚊魚(yú)>幼蟹>青蝦>圓田螺。IVM對(duì)淡水常見(jiàn)橈足類近鄰劍水蚤48 h的LC50值為0.16 μg·L-1[22]。本研究AVM和IVM對(duì)大型蚤的LC50-48h值分別為1.43 μg·L-1和0.51 μg·L-1，表明2種藥物對(duì)大型蚤的毒性遠(yuǎn)大于對(duì)淡水綠藻的。

2.3 AVM和IVM對(duì)大型蚤生長(zhǎng)的影響

大型蚤于不同濃度的AVM中暴露第9天起，最高濃度組(0.16 μg·L-1)的大型蚤開(kāi)始出現(xiàn)死亡，暴露21 d后，最大濃度組的死亡率達(dá)到60%；IVM的0.03 μg·L-1和0.06 μg·L-1暴露組從第7天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，21 d后的0.03 μg·L-1和0.06 μg·L-1暴露組大型蚤死亡率分別達(dá)40%和50%。從藥物暴露后存活的各濃度組中隨機(jī)選取3組進(jìn)行體長(zhǎng)、繁殖等指標(biāo)的測(cè)定和計(jì)算。AVM和IVM暴露21 d的大型蚤體長(zhǎng)變化如圖3所示，結(jié)合顯著性差異分析結(jié)果可見(jiàn)，低濃度0.01～0.04 μg·L-1的AVM暴露下，大型蚤體長(zhǎng)稍有降低，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異；0.08 μg·L-1和0.16 μg·L-1濃度組的大型蚤體長(zhǎng)分別為對(duì)照組的90.8%和78.0%，顯著低于對(duì)照。IVM暴露的大型蚤自0.0075 μg·L-1濃度組開(kāi)始顯著低于對(duì)照，此后隨著藥物暴露濃度的增大，大型蚤體長(zhǎng)緩慢降低。0.0075～0.06 μg·L-1的IVM暴露組大型蚤體長(zhǎng)分別相當(dāng)于對(duì)照值的89.7%、88.2%、87.5% 和84.1%。

圖3 AVM和IVM暴露21 d的大型蚤體長(zhǎng)變化Fig. 3 Body length changes of Daphnia magna exposed to AVM and IVM for 21 d

2.4 AVM和IVM對(duì)大型蚤繁殖的影響

AVM和IVM暴露21 d后大型蚤生殖指標(biāo)的變化情況分別如表2和表3所示，包括第一次產(chǎn)卵時(shí)間、第一次產(chǎn)卵數(shù)等。由表3可知，在整個(gè)藥物作用濃度范圍內(nèi)，大型蚤第一次產(chǎn)卵時(shí)間和每只母蚤的胎數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異；但第一次產(chǎn)卵數(shù)、每只母蚤產(chǎn)幼蚤總數(shù)和凈生殖率均隨藥物暴露濃度的升高而降低，自0.02 μg·L-1暴露組開(kāi)始，以上3個(gè)指標(biāo)均隨著藥物暴露濃度的增大顯著低于對(duì)照。相比之下，內(nèi)稟增長(zhǎng)率自最低濃度0.01 μg·L-1暴露組開(kāi)始即顯著低于對(duì)照，此后隨著藥物暴露濃度的增大更加顯著地降低，表明大型蚤的內(nèi)稟增長(zhǎng)率和凈生殖率是對(duì)AVM較為敏感的指標(biāo)[23]。

表2 AVM對(duì)大型蚤慢性毒性(生殖影響)Table 2 Chronic toxicity of AVM on reproduction of Daphnia magna

由表3可知IVM對(duì)大型蚤的生殖毒性，除第一次產(chǎn)卵時(shí)間在整個(gè)藥物的作用濃度范圍內(nèi)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異外，其余生殖指標(biāo)均隨IVM暴露劑量的增大而表現(xiàn)出顯著降低的變化趨勢(shì)。其中對(duì)IVM最敏感的為幼蚤數(shù)/母蚤和凈生殖率，從0.0075 μg·L-1開(kāi)始即顯著低于對(duì)照；內(nèi)稟增長(zhǎng)率則從0.015 μg·L-1開(kāi)始顯著低于對(duì)照。相比之下，第一次產(chǎn)卵數(shù)和胎數(shù)/母蚤則從0.03 μg·L-1暴露組開(kāi)始顯著低于對(duì)照。

表3 IVM對(duì)大型蚤慢性毒性(生殖影響)Table 3 Chronic toxicity of IVM on reproduction of Daphnia magna

生長(zhǎng)、繁殖作用等是常被用來(lái)評(píng)價(jià)污染物對(duì)大型蚤慢性毒性作用的指標(biāo)[24]。Lopes等[25]通過(guò)試驗(yàn)觀察到IVM對(duì)大型蚤生長(zhǎng)、繁殖的最小有作用劑量為0.01 ng·L-1。AVM和IVM對(duì)大型蚤的慢性毒性較鉛、鎘等重金屬和毒死蜱、三唑磷、氟蟲(chóng)腈等農(nóng)藥[26]、全氟化合物[27]等都更加明顯。本研究發(fā)現(xiàn)AVM和IVM對(duì)大型蚤具有較明顯的慢性生長(zhǎng)抑制和生殖毒性，表現(xiàn)為較高濃度藥物暴露下，大型蚤體長(zhǎng)、第一次產(chǎn)卵數(shù)、幼蚤數(shù)/母蚤、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率均顯著降低，尤其以凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率對(duì)藥物更為敏感。這可能是由于AVM影響了大型蚤生理指標(biāo)及抗氧化能力的結(jié)果。Mahmoud[28]以LC50-96h值的1/10暴露尼羅羅非魚(yú)后，發(fā)現(xiàn)AVM脅迫降低了魚(yú)的生長(zhǎng)性能、生理、免疫力和抗氧化能力。Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1AVM暴露顯著降低中華絨螯蟹血細(xì)胞的細(xì)胞活力，抑制吞噬活性，降低酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，并推測(cè)活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生可能是導(dǎo)致中華絨螯蟹細(xì)胞活力和免疫功能下降的主要原因。此外，AVM類藥物對(duì)水生動(dòng)物還具有一定的神經(jīng)、發(fā)育和免疫等毒性。Raftery和Volz[20]發(fā)現(xiàn)AVM可逆地抑制斑馬魚(yú)早期胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)，認(rèn)為是藥物與斑馬魚(yú)胚胎中氯離子通道門(mén)控配體可逆結(jié)合，抑制神經(jīng)傳遞的結(jié)果。依據(jù)歐盟關(guān)于危險(xiǎn)物質(zhì)分類的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，AVM對(duì)于水生生物屬劇毒，具有較高的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。因此，在水產(chǎn)病害防治中應(yīng)重視AVM類藥物的合理用藥。

2.5 AVM對(duì)大型蚤慢性毒性的顯微鏡觀察

不同濃度AVM暴露21 d后的大型蚤顯微鏡下形態(tài)觀察結(jié)果如圖4所示。由圖4(a)可知，對(duì)照組大型蚤腸道、卵巢和孵育囊中的卵均較清晰；而隨著AVM暴露濃度的增大，大型蚤除體長(zhǎng)變小外，卵巢出現(xiàn)腫脹，尤其以孵育囊中的卵變化更為明顯。至高濃度0.04、0.08和0.16 μg·L-1，卵已經(jīng)模糊不清，表明較高濃度的AVM顯著影響了大型蚤的生長(zhǎng)和生殖，這與前述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖4 AVM暴露21 d的大型蚤顯微鏡觀察結(jié)果注：(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μg·L-1的AVM暴露組。Fig. 4 Microscopic observation of Daphnia magna exposed to AVM for 21 dNote: (a), (b), (c), (d), (e) and (f) represent AVM exposure group of 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08 and 0.16 μg·L-1, respectively.

綜上所述，本研究表明：(1) 最高暴露濃度640 mg·L-1AVM和IVM對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)抑制率分別為55.73%和41.84%；AVM和IVM對(duì)大型蚤的LC50-48h值分別為1.43 μg·L-1和0.51 μg·L-1，表明2種藥物對(duì)淡水綠藻的生長(zhǎng)抑制作用不大，但對(duì)大型蚤均為劇毒；(2) 0.08、0.16 μg·L-1AVM和0.015～0.06 μg·L-1IVM暴露21 d后，大型蚤體長(zhǎng)顯著降低；而大型蚤產(chǎn)卵數(shù)、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率等生殖指標(biāo)對(duì)2種藥物的響應(yīng)較體長(zhǎng)變化更為敏感。