白露 劉靜靜 張歡 何亞飛 劉芳芳 趙瑞娟

(1濮陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 濮陽 457000；2鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在世界癌癥中排名第三，由于缺乏早期診斷，大多數(shù)胃癌患者被診斷時已為晚期，臨床上胃癌手術(shù)后治療失敗的最常見原因是原發(fā)性胃癌中游離癌細(xì)胞的播種引起腹膜轉(zhuǎn)移，而且其高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是胃癌患者低生存率的重要原因〔1〕。研究表明，巨核細(xì)胞白血病因子(MKL)1/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶活性和凋亡抑制因子 (CAAP)1通路參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和遷移等細(xì)胞惡性生物學(xué)行為過程〔2〕。MKL1在許多組織中廣泛表達(dá)，在血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化及腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用〔3,4〕。有研究表明，MKL1也可能參與胃癌細(xì)胞增殖〔5〕。CAAP1通過調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)的表達(dá)和活性，被認(rèn)為是凋亡途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子〔6〕。因此，MKL1/CAAP1通路作為腫瘤治療的新靶點逐漸得到重視。中草藥因毒副作用小和抗腫瘤作用顯著等優(yōu)勢越來越受到研究者的關(guān)注。香青蘭總黃酮是香青蘭的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物活性〔7〕。但關(guān)于香青蘭總黃酮抗腫瘤活性的研究很少。因此，本研究主要檢測香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并探討MKL1/CAAP1通路是否參與這一過程，為研發(fā)胃癌新的治療策略提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞及藥物 人胃癌MGC-803細(xì)胞株(購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，批號：CM-1520)；香青蘭總黃酮(購自新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，原料藥，純度98.5%，批號：JL9017-13)；曲妥珠單抗(購自上海羅氏制藥有限公司，批號：B3344)。

1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(購自美國Gibco公司，批號：PM16000044、10270106)；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、TRIzol試劑、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒、鼠抗人二抗(購自美國Amresco公司，批號：S0793、CA1020、P0033、A2016、L6017)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、MKL1、CAAP1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、Caspase-3和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(購自美國Santa Cruz公司，批號：DRR019A、RR012A、HZ-048245、HZ-018542、HZ-0684R6、HZ-0611R10、HZ-0742R1)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(購自上海道尚生物科技有限公司，型號：Revco Elite I)；酶標(biāo)儀(購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司，型號：HBS-1096B)；顯微鏡(購自日本奧林巴斯公司，型號：CX43)；熒光定量PCR儀(購自西安天隆科技有限公司，型號：DTC-3G)；垂直電泳儀(購自北京德元國際科技有限公司，型號：DYCZ-Mini2)；流式細(xì)胞儀、凝膠成像儀(購自美國UVP公司，型號：CytoNova、GelDoc-IT TS3)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時進(jìn)行實驗。實驗分為對照組，香青蘭總黃酮低、中、高劑量組和曲妥珠單抗組。對照組不進(jìn)行處理，香青蘭總黃酮低、中、高劑量組分別給予濃度為25、50、100 mg/L的香青蘭總黃酮〔8〕，曲妥珠單抗組給予濃度為10 mg/L的曲妥珠單抗，24 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測〔9〕。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖率 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔)，20 h后加入MTT試劑(50 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞增殖率〔細(xì)胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%〕。只含有培養(yǎng)基、MTT試劑、二甲基亞砜設(shè)為空白組。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔)，24 h后收獲細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心棄上清，分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI，充分混勻后室溫避光孵育20 min，檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 按1.3給予受試物干預(yù)后接種在24孔Transwell小室中，下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，24 h后取出小室，擦除上室中的細(xì)胞，用甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察計數(shù)紫色染色的細(xì)胞(侵襲細(xì)胞數(shù))。

1.7細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔)，待細(xì)胞貼壁后，用100 μl槍頭劃“一”字劃痕，24 h后，顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測量劃痕寬度，計算遷移距離(遷移距離=0 h時劃痕寬度-24 h時劃痕寬度)。

1.8實時熒光定量PCR法檢測胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平 將細(xì)胞以1×106個/ml接種于6孔板中(3 ml/孔)，按1.3給予受試物干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)基，加入TRIzol進(jìn)行總RNA提取，測定RNA的濃度和純度，根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，制備20 μl反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，MKL1上游引物為5′-GCGCTGAATCACATGCCAATACAGG-3′，MKL1下游引物為5′-AAGCACTTGGGGGCCGCAGTAGCGCAT-3′；CAAP1上游引物為5′-GGGAGTGAATAACGGGCGAAAAGTA-3′，CAAP1下游引物為5′-TACCTAGGCTGGCTTTTTTATATCA-3′；MMP-2上游引物為5′-CCCTTCAATGGTTGGTACATGG-3′，MMP-2下游引物5′-ACATTGATCTCCGTGACAGCC-3′；Caspase-3上游引物為5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′，Caspase-3下游引物為5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′；β-actin上游引物為5′-TGCGACTTCAACAGCAACTC-3′，β-actin下游引物為：5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′；采用2-△△Ct法計算MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量(以β-actin作為內(nèi)對照)。

1.9免疫印跡法檢測胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平 將細(xì)胞以1×106個/ml接種于6孔板中(3 ml/孔)，按1.3給予受試物干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，根據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提試劑，冰浴裂解2 h，離心取上清，用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與MKL1(1∶300)、CAAP1(1∶200)、MMP-2(1∶400)、Caspase-3(1∶300)和β-actin(1∶2 000)抗體進(jìn)行孵育，4℃過夜，室溫條件下加入鼠抗人二抗(稀釋比1∶5 000)孵育30 min。滴加電化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色，采集圖像，用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)對照。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，各香青蘭總黃酮劑量組細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，呈劑量依賴性，但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖1 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響(MTT染色，×200)

圖2 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

2.2香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對照組比較，各香青蘭總黃酮劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移距離顯著降低，呈劑量依賴性，但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞遷移的影響(×100)

表2 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移的影響

2.3香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平的影響 與對照組比較，各香青蘭總黃酮劑量組胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平顯著降低，呈劑量依賴性，但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表3。

表3 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平的影響

2.4香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響 與對照組比較，各香青蘭總黃酮劑量組胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平顯著降低，呈劑量依賴性，但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表4、圖5。

表4 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響

1～5：對照組、香青蘭總黃酮低劑量組、香青蘭總黃酮中劑量組、香青蘭總黃酮高劑量組、曲妥珠單抗組圖5 香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響

3 討 論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，化療仍然是主要的策略。然而，由于缺乏靶向治療，這些傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)還會對正常組織和細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性〔10〕。因此，從分子水平研究胃癌的病因和發(fā)展機(jī)制，開發(fā)針對腫瘤靶點的靶向藥物蛋白和信號通路成為當(dāng)前研究的重點。天然產(chǎn)物中的抗癌化合物因其良好的安全性和多靶點效應(yīng)，為腫瘤化療提供了一個很有前途的選擇〔11〕。本研究首次證明香青蘭總黃酮能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。曲妥珠單抗被美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性胃癌患者〔12〕。雖然香青蘭總黃酮對胃癌MGC-803細(xì)胞的生物學(xué)作用不如曲妥珠單抗，但考慮到曲妥珠單抗的副作用較多，香青蘭總黃酮還是有進(jìn)一步研究的價值。本研究同時發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮能抑制胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1/CAAP1通路的激活。而CAAP1調(diào)節(jié)Caspase-10依賴的線粒體Caspase-3/9反饋擴(kuò)增環(huán)來調(diào)控細(xì)胞凋亡。因此，MKL1/CAAP1通路可能在胃癌MGC-803細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

MKL1是血清反應(yīng)因子(SRF)的轉(zhuǎn)錄共激活因子。SRF通過與靶基因啟動子區(qū)的高度保守的核苷酸序列〔CC(A/T)6GG〕結(jié)合，調(diào)控與細(xì)胞生長相關(guān)的多種靶基因的表達(dá)〔13〕。研究表明，MKL1參與了多種人類惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制，MKL1通過直接與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6的啟動子結(jié)合以增加其表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲〔14〕。此外，MKL1可以促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔4〕。MMP-2和金屬蛋白酶1組織抑制因子(TIMP-1)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中有兩個關(guān)鍵因素。有報道稱，胃癌中上皮細(xì)胞MMP-2的高表達(dá)與低生存率相關(guān)，胃癌侵襲性中TIMP-1的低表達(dá)與低生存率相關(guān)。在胃癌中，抑制MMP-2或上調(diào)TIMP-1的表達(dá)均可抑制轉(zhuǎn)移〔15～18〕。在本研究中，香青蘭總黃酮能降低胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1和MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，成功地抑制了胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

CAAP1是一種具有強(qiáng)抗凋亡能力的蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)的保守型，可以在各種組織中表達(dá)〔19〕。CAAP1干擾Caspase-10的激活，進(jìn)而有效激活線粒體死亡途徑所需的Caspase-3/9反饋放大環(huán)的生成。在細(xì)胞水平上，當(dāng)CAAP1過表達(dá)時細(xì)胞凋亡水平降低，而當(dāng)CAAP1沉默時細(xì)胞凋亡水平升高，而腫瘤細(xì)胞過度增殖往往與細(xì)胞凋亡和自噬失衡有關(guān)〔20〕。在本研究中，香青蘭總黃酮能降低胃癌MGC-803細(xì)胞中CAAP1和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。因此，MKL1可以靶向CAAP1來抑制胃癌細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)增殖的發(fā)生，這意味著MKL1可以用作胃癌細(xì)胞中的促腫瘤基因。

綜上所述，香青蘭總黃酮可通過抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗癌作用，其機(jī)制可能與MKL1/CAAP1通路的抑制有關(guān)，可能為胃癌的治療提供了一種新的策略。