王燕琴 陳剛 楊松 孫盛洋 任秀英 王偉群 曲義坤

(佳木斯大學(xué) 1醫(yī)務(wù)處校醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫(yī)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

頭頸部癌是上呼吸道和消化道上皮層最常見的惡性腫瘤，其主要包括鼻咽癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、口腔癌和喉癌等〔1〕。病理分型顯示，頭頸部最常見的腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌，約占所有頭頸部惡性腫瘤的90%〔2〕?？谇击[狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，臨床上可見于牙齦、頰黏膜、硬腭、嘴唇、舌體等多個(gè)器官，具有惡性程度高、快速和無限生長、較易浸潤和轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、危害大等特點(diǎn)〔3,4〕。OSCC可占頭頸部癌癥的95%左右，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢，僅過去10年其發(fā)病率就增加了50%〔5〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)在2003年OSCC還是全球第八大常見癌癥，而到了2016年，其已經(jīng)上升為全球第六大惡性腫瘤〔6,7〕。1975～1977年，OSCC患者5年相對(duì)存活率為52.5%，但在隨后的40年中患者每10年的存活率僅增加了2%～3%〔8〕。趨化因子是由機(jī)體細(xì)胞分泌的一類小的細(xì)胞因子信號(hào)蛋白家族，其已被認(rèn)為是在機(jī)體免疫監(jiān)測、發(fā)育、炎癥和癌癥進(jìn)展等過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵介質(zhì)家族。趨化因子功能的實(shí)施主要是通過與不同類型細(xì)胞表面的七次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體 (GPCR) 結(jié)合，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和激活細(xì)胞所必需的信號(hào)通路得以實(shí)現(xiàn)〔9〕。趨化因子GPCRs主要由白細(xì)胞表達(dá)，最初發(fā)現(xiàn)其主要功能是參與白細(xì)胞運(yùn)輸和歸巢、整合素的激活、超氧陰離子的產(chǎn)生及顆粒內(nèi)容物的釋放，這些功能可構(gòu)成宿主抵抗入侵微生物和組織損傷的第一道防線〔10〕。趨化因子家族成員的分子量為8～10 kD，根據(jù)靠近氨基端的前兩個(gè)半胱氨酸的位置，趨化因子蛋白可被分為4個(gè)高度保守的家族，分別為CXC、CC、C和CX3C。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50多種趨化因子和至少有18種人類趨化因子GPCRs〔11〕。除了經(jīng)典的趨化因子GPCRs外，人們最近又鑒定出一些非典型趨化因子受體，它們包括ACKR1～6〔12〕。趨化因子/GPCRs軸的一個(gè)顯著特征是具有混雜的對(duì)應(yīng)關(guān)系，一方面一些趨化因子可結(jié)合一個(gè)以上的GPCRs，而另一方面有些GPCRs也表現(xiàn)出不同親和力的重疊配體特異性〔13〕。趨化因子/GPCRs軸的這種混雜性有利于宿主根據(jù)微環(huán)境的變化靈活地動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)各種機(jī)制〔13〕。除了介導(dǎo)免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移外，趨化因子還被發(fā)現(xiàn)在淋巴組織的發(fā)育、免疫細(xì)胞的成熟及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用〔14〕。此外，趨化因子及其相應(yīng)受體表達(dá)失衡還與人類許多疾病如自身免疫性疾病、炎癥性疾病及腫瘤等有關(guān)〔15〕。在腫瘤中，趨化因子具有直接或間接地影響腫瘤免疫、腫瘤生物表型、腫瘤進(jìn)展、腫瘤治療和患者預(yù)后等作用〔16〕。研究證實(shí)，在腫瘤微環(huán)境(TME)中，腫瘤相關(guān)宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均可釋放一系列不同種類的趨化因子，來引導(dǎo)不同類型免疫細(xì)胞的招募和激活，最終影響抗腫瘤和促腫瘤之間的平衡〔17〕。除了發(fā)揮趨化細(xì)胞的主要功能外，趨化因子還可通過直接靶向TME非免疫細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)，來影響腫瘤發(fā)展演進(jìn)的多個(gè)進(jìn)程，如腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成等〔16〕。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞可刺激基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌促進(jìn)生長的趨化因子，從而建立一種有利于腫瘤進(jìn)程的腫瘤-間質(zhì)相互作用〔18〕。此外，TME的輔助細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(TAMs)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAFs)，也被證明可以產(chǎn)生趨化因子并促進(jìn)腫瘤進(jìn)程〔19，20〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究趨化因子CXCL1影響人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞和試劑 KB人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美國NQBB公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，重組人趨化因子CXCL1蛋白(美國PeproTech公司)、放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解緩沖液和苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(北京白鯊易科技有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程公司)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國MerckMillipore公司)、CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司)、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏顯影液(上海研生生化試劑有限公司)、單克隆小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam公司)、多克隆兔抗人AKT抗體(美國Affinity Biosciences公司)。

1.2CCK-8細(xì)胞增殖檢測 將處于對(duì)數(shù)生長期的KB人口腔上皮癌細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)消化和計(jì)數(shù)；加入適量DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 鏈霉素)將細(xì)胞密度調(diào)至2.0×104個(gè)/ml；吹打混勻細(xì)胞后，向每96孔板中均勻鋪入100 μl細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)量為2×103個(gè)/孔；將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和CXCL1處理組，每組設(shè)置10個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)基中不加CXCL1；CXCL1各處理組加入CXCL1以使各組培養(yǎng)基CXCL1終濃度為5、10、20和30 ng/ml；將細(xì)胞在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；分別向每孔中加入10 μl CCK8檢測試劑，然后在37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；利用酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm波長的吸光度值。

1.3Transwell細(xì)胞遷移檢測 將處于對(duì)數(shù)生長期的KB人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株用無FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)至密度為1.0×105個(gè)/ml；吹打混勻細(xì)胞后，將100 μl細(xì)胞懸液均勻加入Transwell上室中，使細(xì)胞數(shù)量為1×104個(gè)/室；將小室中的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和CXCL1處理組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組下室的培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；CXCL1各處理組下室的培養(yǎng)基分別為CXCL1終濃度為5、10、20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；將細(xì)胞在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用脫脂棉簽擦拭掉小室上表面未遷移的細(xì)胞；用甲醇-結(jié)晶紫液對(duì)附著在下表面的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色5 min；自來水沖洗5 min后在室溫環(huán)境下干燥15 min；于倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，以觀察細(xì)胞遷移情況。

1.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的KB人口腔上皮癌細(xì)胞株培養(yǎng)在6孔板中；對(duì)照組的培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；CXCL1各處理組的培養(yǎng)基分別為CXCL1終濃度為20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；將細(xì)胞在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞懸液，室溫離心10 min(1 000 r/min)；去除上清后，向細(xì)胞沉淀中加入150 μl 含1%PMSF的RIPA蛋白裂解緩沖液，劇烈吹打以使細(xì)胞充分裂解；在4℃環(huán)境下于高速離心20 min(15 000 r/min)；收集上清液，利用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白濃度；將30 μg總蛋白上樣于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠孔道中并進(jìn)行垂直電泳，然后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉后，轉(zhuǎn)印膜分別用β-actin(1∶5 000)和AKT(1∶1 000)一抗在4℃環(huán)境下孵育過夜；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)緩沖液洗除一抗后，將轉(zhuǎn)印膜分別用HRP-羊抗小鼠IgG(1∶10 000)和HRP-羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗在37℃環(huán)境下孵育30 min；PBS-T緩沖液徹底洗滌后，將ECL試劑滴加到轉(zhuǎn)印膜上反應(yīng)，然后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照并測定條帶灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1趨化因子CXCL1促進(jìn)KB細(xì)胞的增殖活性 各組細(xì)胞生長72 h后，經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測所示，對(duì)照組、5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組的吸光度值分別為1.201±0.007、1.503±0.005、1.695±0.010、1.941±0.015和1.661±0.009。與對(duì)照組比較，5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(P=0.000)。該結(jié)果表明，趨化因子CXCL1對(duì)KB人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株的增殖活性有明顯促進(jìn)作用。

2.2趨化因子CXCL1促進(jìn)KB細(xì)胞的遷移活性 各組細(xì)胞遷移24 h后，經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測所示，對(duì)照組、5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(101.2±53.101)個(gè)、(286.0±49.300)個(gè)、(327.0±38.962)個(gè)、(340.6±50.073)個(gè)和(293.6±28.112)個(gè)。與對(duì)照組比較，5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)(P=0.001；P=0.000)。該結(jié)果表明，趨化因子CXCL1對(duì)KB人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株的遷移活性有明顯促進(jìn)作用。

2.3趨化因子CXCL1上調(diào)KB細(xì)胞AKT蛋白水平 對(duì)照組、20和30 ng/ml CXCL1處理組AKT蛋白表達(dá)水平分別是0.539±0.048、0.905±0.090和0.700±0.091。與對(duì)照組比較，20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細(xì)胞的AKT蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.003；P=0.006)。

3 討 論

炎癥是TME的重要組成部分，也是腫瘤的重要標(biāo)志之一。腫瘤相關(guān)炎癥的主要特征包括白細(xì)胞(特別是TAFs)的浸潤，炎癥多肽信使如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-1和趨化因子CXCL8等的存在及組織重塑和血管發(fā)生等〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)，某些癌癥中的炎癥狀況要先于惡性腫瘤的發(fā)展，而在另一些癌癥中，致癌性變化則可對(duì)相應(yīng)促腫瘤炎癥環(huán)境發(fā)揮驅(qū)動(dòng)作用〔22〕。然而，無論炎癥如何起源，其都有助于促進(jìn)惡性細(xì)胞的增殖、存活與轉(zhuǎn)移，刺激血管生成及改變腫瘤細(xì)胞對(duì)激素和化療的敏感性〔22〕。趨化因子是一類小分子分泌性細(xì)胞因子家族成員，其最初被發(fā)現(xiàn)是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等白細(xì)胞的有效引誘劑，因此被認(rèn)為是急、慢性炎癥的重要介質(zhì)。近年來，越來越多的證據(jù)表明，除了炎癥外，趨化因子可在機(jī)體的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)的維持及多種病理生理過程如骨質(zhì)疏松、肥胖和腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔23〕。在腫瘤研究中，人們首先發(fā)現(xiàn)趨化因子在決定腫瘤間質(zhì)的組成方面具有關(guān)鍵作用，但后來證實(shí)其亦可直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成〔24〕。腫瘤的生長和擴(kuò)散是腫瘤細(xì)胞本身及其與TME組分之間動(dòng)態(tài)相互作用的結(jié)果。在這方面，趨化因子即可參與腫瘤細(xì)胞向轉(zhuǎn)移部位的歸巢，又可參與不同類型細(xì)胞如TAMs、CAFs、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TANs)、淋巴細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和內(nèi)皮細(xì)胞向TME招募〔23〕。研究證實(shí)，腫瘤部位的炎性相關(guān)CC(如CCL2、CCL3、CCL5)和CXC(如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8)趨化因子可招募表達(dá)趨化因子CC配體受體2+(CCR2+)的單核細(xì)胞和趨化因子CXC配體受體2+(CXCR2+)的中性粒細(xì)胞進(jìn)入TME，并促使后者分化為TAMs和TANs〔25〕。TME中腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)細(xì)胞及白細(xì)胞均可分泌多種趨化因子，它們可與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體相結(jié)合，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖〔26,27〕。此外，趨化因子還可通過阻止腫瘤細(xì)胞的凋亡和調(diào)節(jié)促凋亡/抗凋亡分子之間的平衡，如下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達(dá)或抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和caspase-9激活來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活〔28〕。CXCL1又名生長相關(guān)癌基因蛋白(GRO)-α，其可通過與其受體CXCR2的相互作用經(jīng)多條信號(hào)途徑參與腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)程〔29〕。本研究證實(shí)，CXCL1處理后KB細(xì)胞AKT蛋白水平也出現(xiàn)上調(diào)，這與我們在BEL-7402肝癌細(xì)胞的研究結(jié)果相一致〔30〕。