茶酒糟中茶多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性的研究

謝雨尋，葉有明*，李龍?jiān)?，曹雪?/p>

（廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546199）

茶葉的成分大多具有營養(yǎng)特性及功能性，有消炎抑菌、降低血脂、血糖、血壓、抗衰老、抗輻射、防癌等作用[1]。采用茶葉浸提、釀制或配制的保健酒既具有茶的芬芳典雅，也具有酒的深沉渾厚，是集營養(yǎng)、保健為一體的多功能飲品。隨著人們保健意識的增強(qiáng)和社會觀念的轉(zhuǎn)變，近年來茶類保健酒受到人們的青睞。

柳州三江地區(qū)是廣西主要的茶葉生產(chǎn)基地，廣西三江縣吉龍農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司以當(dāng)?shù)氐牟枞~與礦泉水為原料，研制生產(chǎn)了國內(nèi)首款蒸餾茶酒，目前已形成了一條年產(chǎn)1 000 t茶酒的生產(chǎn)線。在生產(chǎn)茶酒的過程中，會產(chǎn)生酒糟等副產(chǎn)品，茶酒糟主要由發(fā)酵后的茶葉組成，其富含茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶蛋白、氨基酸、咖啡堿等活性成分，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗癌癥、抗菌、減少膽固醇、降血壓等功效。目前這些茶酒糟主要用作農(nóng)家肥，對環(huán)境有一定的污染，同時造成了大量資源浪費(fèi)。

茶多酚是一種天然抗氧劑，茶多酚的抗氧化機(jī)理是兒茶素分子結(jié)構(gòu)上的羥基（-OH）起到供氫（H）體的作用，與脂肪酸中的游離基相結(jié)合而中斷脂肪酸氧化的連鎖反應(yīng)，抑制氫過氧化物的形成，起到抗氧化作用[2]，其抗氧活性高于一般非酚性或單酚羥基類抗氧劑，主要表現(xiàn)在具有消除人體自由基、抗癌、抗衰老、抑菌消炎、抑制黑色素合成等多種功效，具有很高的利用價值[3]。

目前，茶多酚的主要提取工藝有溶劑提取、離子沉淀、微波輔助提取、樹脂吸附分離、超聲波輔助提取、超臨界流體萃取、酶提取等方法[4-6]，不同的提取工藝都有各自的優(yōu)勢特點(diǎn)，提取使用的原料主要為茶葉或其加工后的副產(chǎn)物，而從經(jīng)過發(fā)酵后的茶酒糟中提取茶多酚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以廣西三江縣吉龍農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)茶酒過程中產(chǎn)生的酒糟為原料，采用水浴振蕩乙醇提取茶多酚，并研究其抗氧化活性。以期為企業(yè)延長生產(chǎn)線，提高產(chǎn)品附加值，減少酒糟對環(huán)境的污染，最終實(shí)現(xiàn)茶酒釀造產(chǎn)生的廢渣資料化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶酒糟：廣西三江縣吉龍農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（光譜純）：北京蘭博維爾科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；L-抗壞血酸、無水碳酸鈉（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；沒食子酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：北京蘭博維爾科技有限公司；30%過氧化氫（分析純）：西隴化工股份有限公司；水楊酸（分析純）：天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C3X-GF701-2-BS-1II電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；800T粉碎機(jī)：永康市紅太陽機(jī)電有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器：杭州旌斐儀器科技有限公司；SHZ-D（III）循壞水式多用真空泵：上海力辰邦西儀器科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；UV-9600紫外-可見分光光度計(jì)：北京北分瑞利分析儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；FR2004B電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；100-1000有限手動可調(diào)移液器：上海力辰邦西儀器科技有限公司；IRAffinity-1S傅里葉紅外光譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚的提取

將茶酒糟放置溫度為60 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱，干燥48 h。將干燥好的茶酒糟粉碎，過40目篩，密封保存?zhèn)溆肹7]。稱取經(jīng)預(yù)處理的茶酒糟粉末1.0 g，固定料液比為1∶30（g∶mL），加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，用保鮮膜封住錐形瓶瓶口（防止乙醇揮發(fā)），在溫度為65 ℃條件下水浴振蕩8 min提取茶多酚。

1.3.2 茶多酚含量的測定方法

堿性條件下，利用福林酚試劑氧化茶多酚中的-OH基團(tuán)，反應(yīng)之后顯示藍(lán)色，在最大吸收波長765 nm條件下，使用沒食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)，配制質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的沒食子酸工作液。移取不同質(zhì)量濃度沒食子酸工作液各1 mL于刻度試管內(nèi)，分別加入5 mL的10%福林酚試劑，反應(yīng)3～8 min后再分別加入4.0 mL的7.5%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容，室溫下靜置反應(yīng)1 h。另移取1 mL蒸餾水按以上相同步驟作為空白對照，最后在波長765 nm條件下測定其吸光度值[8]。

1.3.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]

以各沒食子酸工作液濃度為X軸，吸光度值為Y軸，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=0.167 7+0.004 8X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，說明在沒食子酸質(zhì)量濃度10～50 μg/mL范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，可以用于茶多酚提取量的測定。

1.3.4 茶多酚提取量的測定

待測液：移取提取液1 mL至10 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，待測（若樣液吸光度高于50 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，則應(yīng)重新稀釋待測液，再次測定其吸光度值[18]。

移取1.0 mL待測液于刻度試管，再移取10%福林酚試劑5 mL，室溫下反應(yīng)3～8 min，然后加7.5% Na2CO3溶液4.0 mL，用蒸餾水定容，搖勻。室溫下靜置反應(yīng)1 h。最后在波長765 nm條件下測定吸光度值，利用所測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，按下式計(jì)算茶多酚的提取量[10]：

式中：W為茶多酚提取量，mg/g；C為提取液中茶多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V為茶多酚待測液體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；M為茶酒糟粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 茶多酚提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)[11]

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶多酚提取量的影響

稱取6份經(jīng)預(yù)處理的茶酒糟粉末各1.0 g，固定料液比為1∶30（g∶mL），分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，用保鮮膜封住錐形瓶瓶口（防止乙醇揮發(fā)），在溫度為65 ℃條件下水浴振蕩8 min提取茶多酚，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶多酚提取量的影響。

（2）提取時間對茶多酚提取量的影響

稱取6份茶酒糟粉末各1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶30（g∶mL），瓶口密封，在水浴溫度65 ℃條件下分別振蕩2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min提取茶多酚，研究不同提取時間對茶多酚提取量的影響。

（3）料液比對茶多酚提取量的影響

稱取6份茶酒糟粉末各為2.50 g、1.67 g、1.25 g、1.00 g、0.83 g、0.71 g，加入25 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，即料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL），用保鮮膜封住瓶口，在溫度65 ℃條件下水浴振蕩10 min提取茶多酚，研究不同料液比對茶多酚提取量的影響。

（4）提取溫度對茶多酚提取量的影響

稱取6份茶酒糟粉末各1 g，固定料液比為1∶25（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，瓶口封住，水浴溫度分別為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，振蕩10 min提取茶多酚，研究不同提取溫度對茶多酚提取量的影響。

1.3.6 茶多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)[13-15]

參照單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）為試驗(yàn)因素，采用L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，確定提取茶多酚最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extraction process optimization

1.3.7 紅外光譜檢測實(shí)驗(yàn)[17-19]

（1）茶多酚樣品制備

將茶多酚提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至黏稠狀，轉(zhuǎn)移至平皿中，60 ℃條件下烘干，得到茶多酚粗制品，研磨成粉末狀，-20 ℃保存[7]，用于紅外光譜檢測。

（2）紅外光譜檢測方法

將茶多酚粉末按1∶100的質(zhì)量比與溴化鉀混合，研磨均勻后用壓片機(jī)壓制成薄片供測定，以溴化鉀為背景，設(shè)置光譜范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為2 cm-1，掃描次數(shù)為32次[11]。

1.3.8 茶多酚的抗氧化活性研究

（1）茶多酚提取液制備

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝提取茶多酚，使用循環(huán)水式多用真空泵對其進(jìn)行抽濾，通過60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使溶液大約減少1/3，將所得溶液放置冰箱保存[16]，用于研究茶多酚的抗氧化活性試驗(yàn)。

（2）羥自由基清除率測定[12]

移取1 mL不同濃度梯度的茶多酚提取液于試管，然后依次向試管分別加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2各1 mL，在37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比在波長510 nm處測定其吸光度值，記為Ai。按照以上步驟把1 mL茶多酚提取液換成1 mL蒸餾水，其余步驟相同，作空白對照，測定吸光度值，記為Ao。

考慮到色素本身的吸光度值，移取1mL不同濃度梯度的茶多酚提取液至試管，接著依次向試管分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各1 mL，最后不加H2O2啟動反應(yīng)，而是加1 mL蒸餾水。37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比在波長510 nm處測定其吸光度值，記為Aj。

以維生素C（vitamin C，VC）作對照，進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。按下式計(jì)算茶多酚對羥自由基的清除率：

式中：Ao為空白對照；Ai為樣品組的吸光度值；Aj為樣品本底的吸光度值。

（3）DPPH自由基清除率測定[12]

向試管加入0.4 mL不同質(zhì)量濃度的茶多酚提取液，分別加入4 mL的0.1 mmol/L DPPH溶液，放到黑暗環(huán)境靜置反應(yīng)30 min，然后用乙醇作為參比，在波長517 nm條件下測定其吸光度值，記為Ax。按以上步驟把0.4 mL茶多酚提取液換成0.4 mL的乙醇溶液進(jìn)行試驗(yàn)，作為空白對照，記為Ao。

考慮到色素本身的吸光度值，移取不同質(zhì)量濃度的茶多酚提取液各0.4 mL至試管，分別加入4 mL的乙醇溶液，放到黑暗處靜置30 min，以乙醇作為參比，測定其吸光度值，記為Ay。

以VC作對照，進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。按下式計(jì)算茶多酚對DPPH自由基的清除率：

式中：Ao為空白對照；Ax為樣品組的吸光度值；Ay為樣品本底的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶多酚提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶多酚提取量的影響見圖1。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～80%范圍內(nèi)，茶多酚提取量先增大后降低；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時茶多酚的提取量為34.32 mg/g，達(dá)到最高值。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%時，茶多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢?？赡苁且?yàn)檩^高的乙醇體積分?jǐn)?shù)會引起茶酒糟中的茶多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)沉淀，從而導(dǎo)致茶多酚沉淀，因此提取液中茶多酚含量降低[7]。所以，通過單因素試驗(yàn)，可以初步確定茶多酚提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on tea polyphenols extraction

2.1.2 提取時間對茶多酚提取量的影響

提取時間對茶多酚提取量的影響見圖2。由圖2可知，提取時間在2～10 min范圍內(nèi)時，茶多酚提取量隨著振蕩時間的延長而逐漸增大并達(dá)到最大值35.63 mg/g，說明提取時間的延長有利于茶多酚的提取，當(dāng)提取時間超過10 min，茶多酚提取量下降，是因?yàn)殡S著反應(yīng)時間延長，茶多酚中的多酚羥基容易被氧化，會致使其氧化分解，從而茶多酚提取量減少[13]。因此，可以確定最佳提取時間為10 min。

圖2 提取時間對茶多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on tea polyphenols extraction

2.1.3 料液比對茶多酚提取量的影響

料液比對茶多酚提取量的影響見圖3。由圖3可知，料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）范圍內(nèi)，茶多酚提取量隨著料液比減小而逐漸升高，最大值為36.13 mg/g。當(dāng)液料比＜1∶25（g∶mL）時，提取量變化幅度小，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外的茶多酚已充分的溶解出來[7]。因此，初步確定最佳料液比為1∶25（g∶mL）。

圖3 料液比對茶多酚提取量的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on tea polyphenols extraction

2.1.4 提取溫度對茶多酚提取量的影響

提取溫度對茶多酚提取量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)提取溫度范圍在25～75 ℃時，隨著提取溫度升高，茶多酚的提取量呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，在75 ℃條件下茶多酚的提取量達(dá)到38.73 mg/g。已知乙醇的沸點(diǎn)為78.4 ℃，因此提取溫度不能＞78.4℃，即初步確定提取茶多酚最佳提取溫度為75 ℃。

圖4 提取溫度對茶多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on tea polyphenols extraction

2.2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗(yàn)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）為評價指標(biāo)，以茶多酚提取量為評價因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction process optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，4個因素對茶多酚提取量的影響次序依次為D（提取溫度）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（料液比）＞B（提取時間），通過極差分析結(jié)果可知，茶多酚的最優(yōu)乙醇提取工藝組合為A3B4C4D4，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時間為12 min，料液比為1∶30（g∶mL），提取溫度為75 ℃。

由表3可知，提取溫度對茶多酚提取效果有極顯著影響（P＜0.01），乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果影響顯著（P＜0.05），提取時間和料液比兩個因素對茶多酚提取效果均不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)提取茶多酚，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時間12 min，料液比1∶30（g∶mL），提取溫度75 ℃。得到茶多酚提取量分別為41.61 mg/g、42.00 mg/g、40.96 mg/g，平均值為41.52 mg/g，高于正交試驗(yàn)結(jié)果中的最大提取量40.26 mg/g，表明該方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于提取茶酒糟中的茶多酚。

2.3 紅外光譜檢測結(jié)果分析

紅外光譜圖（圖5）可以看出，茶多酚樣品在波數(shù)3432cm-1出現(xiàn)吸收峰，是O-H伸縮振動區(qū)，波數(shù)3 078 cm-1處有吸收峰為不飽和碳上的C-H伸縮振動區(qū)，在波數(shù)2 864 cm-1上的吸收峰為C-H伸縮振動區(qū)，波數(shù)1 695 cm-1是羰基的伸縮振動區(qū)，吸收峰1 424 cm-1、1 294 cm-1和1 187 cm-1為C-O伸縮振動區(qū)，波數(shù)939.4cm-1、711.7 cm-1是C-H面外彎曲振動區(qū)[20-22]。所以推斷出此樣品中含有羰基、羥基等官能團(tuán)，和茶多酚的主要官能團(tuán)基本符合。

圖5 茶多酚樣品紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrogram of tea polyphenols samples

2.4 抗氧化活性研究試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 茶多酚對羥自由基的清除效果

茶多酚對羥自由基的清除效果見圖6。由圖6可知，茶多酚質(zhì)量濃度在1～6 mg/mL范圍內(nèi)，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的增大，其對羥自由基的清除率也逐漸升高，達(dá)到91.72%的清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度＞5 mg/mL時其清除率趨于平緩。與VC作對照，在0.2～6 mg/mL范圍內(nèi)，VC對羥自由基的清除率呈現(xiàn)一直上升的趨勢[23]，當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，其對羥自由基清除率達(dá)到99.23%。

圖6 茶多酚對羥自由基的清除效果Fig.6 Scavenging effect of tea polyphenols on hydroxyl radical

通過計(jì)算得出茶多酚的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為2.74 mg/mL，VC的IC50值為0.35 mg/mL。表明茶多酚對羥自由基的清除效果不如VC，但也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[24]。

2.4.2 茶多酚對DPPH自由基的清除效果

茶多酚對DPPH自由基的清除效果見圖7。由圖7可知，在50～300 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的升高，其對DPPH自由基的清除效果逐漸變好[25]，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度＞300 μg/mL時，其清除率趨于穩(wěn)定，達(dá)到93.7%。與VC作對照，在50～200 μg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)一直上升的趨勢，VC質(zhì)量濃度為180 μg/mL，其對羥自由基清除率達(dá)到95.8%。

圖7 茶多酚對DPPH自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of tea polyphenols on DPPH free radicals

計(jì)值算得出茶多酚和VC的IC50值分別為151.59 μg/mL、117.23 μg/mL，表明從茶酒糟中提取的茶多酚對DPPH自由基清除效果弱于VC，但茶多酚仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性。

3 結(jié)論

該研究從茶酒糟提取茶多酚，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間12 min，料液比1∶30（g∶mL），提取溫度75 ℃。在此最佳提取工藝條件下，茶多酚的提取量為41.52 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對茶酒糟進(jìn)行水浴振蕩乙醇提取茶多酚方法合理可行。對從茶酒糟中提取的茶多酚進(jìn)行抗氧化性研究中，茶多酚對羥自由基和DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除效果，表明其是一種很好的天然抗氧化劑。對茶多酚樣品進(jìn)行紅外光譜分析得出樣品中含有茶多酚主要的官能團(tuán)。

本研究對從茶酒糟中提取茶多酚及其抗氧化活性研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處，需要進(jìn)一步研究。對提取得到的茶多酚進(jìn)行純化試驗(yàn)研究，得到純度更高的茶多酚制品。本試驗(yàn)研究茶多酚提取液對自由基的清除效果，今后可研究提取液應(yīng)用于果蔬、肉類的抗氧化。