吳彩葉 湯海青 歐昌榮

(1 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校食品學(xué)院，浙江 寧波 315500；2 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800)

魚(yú)類因富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素而營(yíng)養(yǎng)豐富，是人類飲食中動(dòng)物性蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一。但魚(yú)類及其制品在加工及貯藏期間極易發(fā)生腐敗，且魚(yú)體或環(huán)境中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物可能將氨基酸脫羧形成生物胺[1]，增加生物胺中毒的風(fēng)險(xiǎn)。生物胺是一類具有生物活性的小分子量含氮化合物，適量的生物胺對(duì)人體的生理功能具有有益作用，但攝入過(guò)量可能引起多種不適[2-4]。近年來(lái)，生物胺中毒事件主要集中在因食用青皮紅肉魚(yú)而引起的組胺中毒。由于生物胺的過(guò)量產(chǎn)生意味著食品品質(zhì)降低和安全性問(wèn)題，因此食品中組胺及酪胺等生物胺的含量也被作為評(píng)價(jià)食品安全的重要指標(biāo)[5]。

在食品加工及貯藏過(guò)程中對(duì)潛在的組胺超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行控制，降低組胺含量，對(duì)于保證食品品質(zhì)具有重要意義。根據(jù)組胺產(chǎn)生機(jī)理，可從兩個(gè)方面進(jìn)行：1)控制食品中的產(chǎn)胺菌，抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)胺，從而減少組胺的生成；2)對(duì)食品中已產(chǎn)生的組胺進(jìn)行降解處理。目前，在加工及貯藏過(guò)程中，通常使用物理手段抑制產(chǎn)胺菌，如低溫貯藏、臭氧處理、輻照殺菌、超高壓滅菌、氣調(diào)控制等[6-10]。這些方法需專用設(shè)備且耗能較大，雖在一定程度上減少了生物胺的產(chǎn)生，但不能消除已產(chǎn)生的生物胺。與上述方法比較，生物控制方法，如添加特定微生物或酶，可降解生物胺，從而降低食品中的生物胺含量。已有研究表明在腌漬魚(yú)[11]、魚(yú)露[12]和魚(yú)醬[8]中接種組胺降解菌，通過(guò)其生長(zhǎng)產(chǎn)酶，降解了原料中本身存在的及加工貯藏中產(chǎn)生的組胺，同時(shí)減弱了魚(yú)腥味、氨味、腐臭味，提高了感官品質(zhì)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。因此，生物胺降解菌的底物多樣性、降解效率和安全性等研究，成為開(kāi)發(fā)生物胺控制技術(shù)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵鯖魚(yú)中強(qiáng)化接種降解生物胺的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?，本試驗(yàn)從傳統(tǒng)發(fā)酵鯖魚(yú)中篩選分離出具有組胺降解活性的微生物，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定分類地位，考察該菌的生長(zhǎng)和降解特性，初步分析其產(chǎn)組胺降解酶的粗酶特性，并將該菌接種至傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，研究其在發(fā)酵中對(duì)組胺等生物胺的影響，以期為水產(chǎn)食品的生物胺控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯖魚(yú)(Scomberjaponicus)，每尾重350±35 g，購(gòu)自寧波M6生鮮超市，置于無(wú)菌保鮮袋內(nèi)并用冰塊保存，立即運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行發(fā)酵魚(yú)的制備。散裝酒釀，原輔料包括水、糯米和酒曲，未殺菌，購(gòu)自寧波三江購(gòu)物超市。

組胺、組胺鹽酸鹽，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、組胺、2-苯乙胺、酪胺和色胺等8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)，1,7-二氨基庚烷(≥98%)，美國(guó)Sigma公司；乙腈、乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸、七氟丁酸，均為色譜純，德國(guó)Merck公司；乳酸細(xì)菌(man rogosa sharpe，MRS)培養(yǎng)基，結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(violet red bile dextrose agar，VRBDA)培養(yǎng)基，2216E瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；BSA224S電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KS-600E I型超聲清洗器，寧波署科儀器有限公司；HWS 智能型恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；SW CJ-1D 超凈工作臺(tái)，河南天馳儀器設(shè)備有限公司；Alliance e2695/Xevo TQ MS液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱ACQUITY HSS T3(100 mm ×2.1 mm, 1.8 μm)，美國(guó)Waters公司；IKA T18 ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)制備 將新鮮的鯖魚(yú)洗凈，去頭、尾和內(nèi)臟，切成3 cm×4 cm的小塊，按10∶1(魚(yú)/鹽質(zhì)量比，w/w)加入食鹽，均勻涂抹，4℃下腌制48 h，瀝干。經(jīng)熱風(fēng)干燥12 h至含水量為45%±5%，裝瓶，按1∶1(魚(yú)/酒釀質(zhì)量比，w/w)加入酒釀，壓實(shí)并密封，于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 菌株篩選分離 分別以MRS、VRBDA和2216E瓊脂做為分離培養(yǎng)基。取25 g發(fā)酵魚(yú)樣品，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，在均質(zhì)袋內(nèi)勻漿。經(jīng)10倍梯度稀釋后，選取10-3、10-4、10-5稀釋度涂布于分離培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48 h。結(jié)合菌落特點(diǎn)挑取單菌落接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定組胺濃度和酶活力。篩選不產(chǎn)組胺且組胺降解活力較高的菌株，經(jīng)平板劃線分離純化后,于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面4℃保藏備用。

1.3.3 組胺含量及組胺降解酶活力的測(cè)定 菌體培養(yǎng)物中組胺含量及酶活力的測(cè)定依據(jù)Okayama等[13]的方法并稍作修改。取2 mL菌體培養(yǎng)物，4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min。取上清液0.5 mL測(cè)定組胺含量。另取上清液0.5 mL于10 mL玻璃試管中，加入0.5 mL酶反應(yīng)混合液[包括0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.4)、1 000 μg·mL-1組胺、0.1 mmol·L-1氨基胍]，37℃反應(yīng)20 min，結(jié)束時(shí)加入0.5 mol·L-1鹽酸終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)中在波長(zhǎng)460 nm下測(cè)定吸光值OD460值。對(duì)照組加入上清液和酶反應(yīng)混合液后，立即加入0.5 mol·L-1鹽酸終止反應(yīng)。酶活單位定義為：每mL樣液使反應(yīng)體系在1 min 內(nèi)組胺減少1 μg所含的酶量為一個(gè)酶活單位(enzyme activity, EA，U·mL-1)。

1.3.4 菌種鑒定 對(duì)組胺降解菌進(jìn)行形態(tài)觀察、革蘭氏染色、氧化酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，并進(jìn)一步使用16S rRNA基因序列分析進(jìn)行菌種鑒定。將純化的菌株交于蘇州泓訊生物有限公司進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序，選用引物為通用引物(27F和1492R)。將得到的16S rRNA序列提交到基因庫(kù)(GenBank)，用BLAST軟件與已知序列進(jìn)行對(duì)比，使用鄰接法(Neighbour-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定所測(cè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.5 生長(zhǎng)條件對(duì)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 將新鮮培養(yǎng)的菌株接種到裝有50 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的參數(shù)：培養(yǎng)溫度(4、20、25、30、35、40、45℃)；pH值(4、5、6、7、8、9)；NaCl濃度(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%)。搖瓶轉(zhuǎn)速160 r·min-1，培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定菌體培養(yǎng)物的OD600值和酶活力。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究 將菌體培養(yǎng)物上清液在不同溫度(20、25、30、35、40、45℃)和不同pH緩沖體系(pH值3～8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH值8～10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定酶活力以確定其反應(yīng)的最適溫度和最適pH值。將酶液在30℃下不同pH值(5、6、7、8、9、10)的緩沖液中保存1 h，調(diào)節(jié)至最適pH值測(cè)定酶活力，以確定酶的pH值穩(wěn)定性，在不同溫度(20、25、30、35、40、45℃)下置于pH值7的緩沖體系中反應(yīng)，測(cè)酶活力確定其熱穩(wěn)定性。通過(guò)向酶反應(yīng)體系中分別加入金屬離子Na+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、 K+和Fe3+以及乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid, EDTA)的溶液，使其在反應(yīng)體系中的終濃度均達(dá)到5 mmol·L-1，測(cè)定酶活力。

1.3.7 發(fā)酵魚(yú)的人工接種 將篩選得到的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，于4℃、10 000 r·min-1離心10 min，用0.85%無(wú)菌生理鹽水將菌體重懸后，離心重復(fù)上述操作1次，制備107CFU·mL-1菌懸液，置于4℃冰箱備用。按1.3.1分別制備發(fā)酵鯖魚(yú)對(duì)照組和接種組。接種組在裝瓶前，采用噴灑方式將菌懸液接種到腌制并干燥的魚(yú)體中，接種量5%(每100 g魚(yú)體接種5 mL菌懸液)，按1∶1(魚(yú)/酒釀質(zhì)量比)加入酒釀。置于30℃恒溫箱發(fā)酵16 d，每4 d取樣測(cè)定生物胺含量。

1.3.8 發(fā)酵魚(yú)生物胺含量的測(cè)定 使用液相色譜-質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)進(jìn)行發(fā)酵魚(yú)中生物胺含量的測(cè)定。具體過(guò)程如下：取2 g發(fā)酵魚(yú)樣品，加入20 mL水后，用勻漿機(jī)進(jìn)行均質(zhì)。勻漿結(jié)束后，分別加入20 mL乙腈、3 mL乙醇、5 mL正己烷，混勻，于4℃、5 000 r·min-1條件下離心5 min，取下層液體，加入2 mL二氯甲烷混勻。再次用離心機(jī)在相同條件下離心5 min，棄上清液后再加入1 mL二氯甲烷，混勻后離心取上清液，用0.22 μm膜過(guò)濾后上機(jī)。色譜柱：ACQUITY HSS T3 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：2 mmol·L-1乙酸銨(A)-含0.1%甲酸的甲醇(B)；梯度洗脫：0～0.1 min，95%A；0.1～9.85 min，95%～0%A；9.85～11.4 min，0%A；11.4～11.5 min，0%～95%A；11.5～14 min，95%A；柱溫：30℃；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL。質(zhì)譜條件包括：ESI離子源(正離子模式)；離子噴霧電壓(3 500 V)；錐孔電壓(15 V)；脫溶劑溫度(500℃)；脫溶劑流量(1 100 L·h-1)；錐孔氣流量(100 L·h-1)；碰撞氣流量(0.15 mL·min-1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan差異顯著性檢驗(yàn)和Person相關(guān)性分析，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選和鑒定

經(jīng)平板分離、酶活力和組胺測(cè)定以及菌種鑒定，得到多株具有組胺降解能力的革蘭氏陰性菌(表1)，部分菌株同時(shí)具有產(chǎn)組胺能力。其中，使用2216E培養(yǎng)基分離的菌株V-TB-2-5的組胺降解能力較高，且不產(chǎn)組胺。該菌株于30℃在2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈枚紅色，圓形，邊緣整齊光滑。經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性菌，短桿狀，菌體大小為0.8 μm×0.3 μm。

表1 部分菌株產(chǎn)組胺降解酶和產(chǎn)組胺能力的比較Table 1 Comparison of histamine-degrading enzyme and histamine production by bacterial strains

對(duì)菌株V-TB-2-5的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序得到1 381 nt核苷酸序列，在GenBank中提交并與模式菌株進(jìn)行同源性比較，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，分離菌株V-TB-2-5與產(chǎn)氮假單胞菌Pseudomonasazotoformansstrain WXCDD51聚類在一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，16S rRNA序列的一致性高達(dá)99%。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)，可基本確定分離菌株為一種產(chǎn)氮假單胞菌，命名為Pseudomonasazotoformansstrain V-TB-2-5。與圖1中顯示的親緣關(guān)系較近的雪松假單胞菌(Pseudomonascedrella)和邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginalis)同屬于假單胞屬rRNAI群熒光DNA同源組。

圖1 菌株V-TB-2-5的基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain V-TB-2-5 and other reference species based on 16S rRNA gene sequence

2.2 生長(zhǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

菌株V-TB-2-5在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，組胺降解酶的生成和菌株生長(zhǎng)基本同步，主要來(lái)源于菌的初級(jí)代謝(圖2-A)。20～40℃為該菌適宜的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶溫度范圍，并在30℃達(dá)到峰值，為典型的中溫菌(圖2-B)。在pH值5～8的范圍內(nèi)，該菌能夠保持良好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力，適合中性偏酸的生長(zhǎng)環(huán)境，過(guò)酸和過(guò)堿的條件均會(huì)抑制其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活力 (圖2-C)。該菌在1.5%的NaCl發(fā)酵液中生長(zhǎng)良好，且保持較高的酶活力，但隨著NaCl濃度增大，對(duì)菌株的抑制作用也越明顯；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3.5%以上，菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活力被抑制(圖2-D)。

圖2 生長(zhǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of growth conditions on growth and enzyme production of strain

2.3 酶學(xué)特性研究

對(duì)發(fā)酵液中組胺降解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的反應(yīng)最適pH值為7，且在pH值3～9范圍內(nèi)均可達(dá)到50%以上的相對(duì)酶活力(圖3-A)。將酶在不同ph值的緩沖液中保存1 h后測(cè)定酶活力，考察pH值穩(wěn)定性。該酶的pH值穩(wěn)定范圍為5～7，酶活力保持在90%以上，隨著pH值的升高，酶活力的損失程度也隨之增加(圖3-B)。酶反應(yīng)的最適溫度為30～35℃，在20～45℃的范圍內(nèi)可保持60%以上的酶活力(圖3-C)，酶的穩(wěn)定性隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低(圖3-D)。說(shuō)明該酶的工作pH值和溫度范圍以及酶的穩(wěn)定性適中，符合本研究鯖魚(yú)發(fā)酵的工作條件。由表2可知，在Mn2+、Mg2+和K+等離子存在時(shí)，酶活力增加；而當(dāng)Fe3+離子存在時(shí)，酶活力下降；并且在EDTA存在下酶活力完全喪失，說(shuō)明該酶的正常功能與某些金屬離子有關(guān)，為金屬酶。

表2 金屬離子對(duì)組胺降解酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions on histamine-degrading enzyme activity

2.4 組胺降解菌降解特性的研究

應(yīng)用菌株V-TB-2-5強(qiáng)化接種發(fā)酵鯖魚(yú)，考察其在實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中對(duì)組胺及其他生物胺的降解能力。發(fā)酵鯖魚(yú)產(chǎn)品的成熟時(shí)間為12 d，取樣至16 d。在鯖魚(yú)對(duì)照組的發(fā)酵過(guò)程中，常見(jiàn)的8種生物胺隨時(shí)間的延長(zhǎng)，不斷的積累或消耗(圖4)，組胺、酪胺、亞精胺和色胺發(fā)生了積累，精胺和腐胺含量先升高后降低，尸胺和苯乙胺含量在發(fā)酵過(guò)程中整體呈下降趨勢(shì)。其中，組胺、亞精胺、尸胺和精胺的含量相對(duì)豐富，最高量分別達(dá)到1 142.8 μg·kg-1(12 d，對(duì)照組)、1 137.6 μg·kg-1(16 d，對(duì)照組)、692.9 μg·kg-1(0 d，對(duì)照組)、1 089.9 μg·kg-1(12 d，接種組)。接種后，3種生物胺的含量出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，尸胺含量在不同時(shí)間的降解率為13.1%～19.6%，組胺為18.2%～40.7%，亞精胺為95.8%～97.2%。同時(shí)，觀察到人工接種組的精胺含量在8～16 d增加了49.4%～113.6%。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Difference lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.圖4 菌株V-TB-2-5發(fā)酵魚(yú)中生物胺的降解情況Fig.4 Degradation of biogenic amines in fermented fish inoculated by strain V-TB-2-5

3 討論

從魚(yú)露、發(fā)酵魚(yú)及香腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選分離微生物，是獲得組胺生成菌和降解菌的主要途徑[14]。本試驗(yàn)從傳統(tǒng)發(fā)酵鯖魚(yú)中篩選得到的組胺降解菌中，若干菌株能夠在發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)產(chǎn)生組胺，這與其他從發(fā)酵食品中分離組胺相關(guān)菌的研究結(jié)果相似[15-16]。

本試驗(yàn)分離得到的產(chǎn)氮假單胞菌屬于假單胞菌屬熒光假單胞菌組。假單胞菌屬(Pseudomonadaceaesp.)多分布于土壤、水及各種植物體中，具有極強(qiáng)的分解有機(jī)物的能力[17]。已報(bào)道的產(chǎn)氮假單胞菌分布于深海沉積物、植物根系及畜產(chǎn)品等[18-19]，被用于改善土質(zhì)、抗植物病害、增強(qiáng)植物生長(zhǎng)或提高產(chǎn)量等[20]。根據(jù)文獻(xiàn)，鮮見(jiàn)該菌具有組胺降解能力的報(bào)道。菌株V-TB-2-5發(fā)酵產(chǎn)酶的生物合成模式是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，在不同培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)和發(fā)酵液酶活的趨勢(shì)均保持一致，并在相同時(shí)間出現(xiàn)高峰。說(shuō)明該菌株在發(fā)酵初期將組胺降解酶分泌到胞外，從而對(duì)組胺進(jìn)行代謝并獲得菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和能量。一般來(lái)說(shuō)，不同來(lái)源的組胺降解菌和降解酶對(duì)環(huán)境條件的耐受程度不同。Murooka等[21]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的組胺降解酶是內(nèi)源性酶，培養(yǎng)基pH值過(guò)酸或過(guò)堿可能使細(xì)胞活力喪失，從而影響組胺降解活性。此外，從嗜鹽性分析，菌株生長(zhǎng)的適宜氯化鈉濃度為0～3.5%，說(shuō)明對(duì)氯化鈉的耐受性一般，可能不適合應(yīng)用于其他高鹽的發(fā)酵水產(chǎn)品，如魚(yú)露等。

該酶的最適溫度范圍為30～35℃、最適pH值7，與菌株生長(zhǎng)條件相似，符合生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型的特征。各酶學(xué)性質(zhì)參數(shù)基本符合部分組胺降解酶的相關(guān)報(bào)道，如最適pH值為中性以及金屬酶特性[22]。由于來(lái)源和菌種不同，組胺降解酶的酶學(xué)性質(zhì)也存在一定差異。如Xu等[23]分離的汕頭鹽單胞菌(HalomonasshantousisSWA25)在30～40℃時(shí)生物胺降解活性最高，與本研究相似；而Tapingkae等[24]分離到的1株組胺降解菌N.gari在40～55℃時(shí)活性最高，Sekiguchi等[25]分離到的組胺氧化酶在60℃時(shí)仍能保持較好的活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)溫度和pH值的敏感性均較高，與Heo等[22]的報(bào)道一致。綜合來(lái)看，菌株的生長(zhǎng)條件與酶學(xué)性質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)均符合發(fā)酵鯖魚(yú)的生產(chǎn)條件，具備實(shí)際應(yīng)用的可能性。

不同細(xì)菌的生物胺代謝能力差別很大，大部分菌株只能代謝1～2種生物胺，部分菌株可同時(shí)產(chǎn)生或降解多種生物胺，如Ben-Gigirey等[26]從冷凍金槍魚(yú)中分離的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)可同時(shí)產(chǎn)生組胺和精胺，Jiang等[27]從魚(yú)醬油中篩選的汕頭鹽單胞菌(HalomonasshantousisSWA25)可同時(shí)高效降解8種生物胺。本試驗(yàn)通過(guò)強(qiáng)化接種菌株V-TB-2-5，對(duì)發(fā)酵鯖魚(yú)中3種生物胺有降低作用，降解率>10%。組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，接種后降解率達(dá)到40.7%，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室條件下可對(duì)發(fā)酵鯖魚(yú)中的組胺進(jìn)行有效降解。不同細(xì)菌對(duì)組胺的降解能力有所差異，并受到環(huán)境條件和微生物群落等因素的影響，Lee等[28]在鹽漬魚(yú)發(fā)酵中接種多粘芽孢桿菌(BacilluspolymyxaD05-1)，組胺降解率為34%；藍(lán)翔等[29]在魚(yú)露發(fā)酵中接種降胺菌M.farinoseA3和E.faeciumR7，80 d時(shí)組胺降解率最高，達(dá)到54.75%；Zaman等[30]從魚(yú)醬油中分離的肉糖葡萄球菌(StaphylococcuscarnosusFS19)，其組胺降解率受NaCl濃度的影響，在18%NaCl的魚(yú)醬油中，降解率為15.1%，在NaCl濃度為21%時(shí)降低至13.8%。另外，本試驗(yàn)中發(fā)酵鯖魚(yú)的原料采購(gòu)和加工過(guò)程均嚴(yán)格遵守衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，生物胺水平遠(yuǎn)低于各國(guó)水產(chǎn)品的安全限值[31]。但在貯藏和發(fā)酵條件不當(dāng)時(shí)，青皮紅肉魚(yú)及相關(guān)產(chǎn)品易被摩根菌屬及發(fā)光細(xì)菌等組胺產(chǎn)生菌污染，造成組胺含量超標(biāo)[32]，從而引起食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

除組胺外，菌株V-TB-2-5對(duì)尸胺、亞精胺和精胺含量有明顯的調(diào)節(jié)作用，且亞精胺和精胺之間存在顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05)。許女等[33]在青魚(yú)魚(yú)肉發(fā)酵香腸中接種乳酸菌發(fā)酵劑后，亞精胺下降極顯著，但其對(duì)照組和接種組均未檢測(cè)到精胺。從生物胺的形成途徑來(lái)看，亞精胺是精胺的前體物質(zhì)，因此推測(cè)菌株V-TB-2-5可能在發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)產(chǎn)生了精胺合成酶。發(fā)酵食品中生物胺的降解機(jī)制復(fù)雜，與發(fā)酵劑的種類和添加量、發(fā)酵體系的成分及環(huán)境條件等有關(guān)[14]，如Leuschner等[34]發(fā)現(xiàn)M.variansLTH 1540 菌株具有降解酪胺活性，但其酶活性在pH低于5時(shí)受到強(qiáng)烈的抑制。與對(duì)照組比較，本試驗(yàn)接種組中未發(fā)現(xiàn)對(duì)其他生物胺的降解作用，可能是由于該菌株在發(fā)酵環(huán)境中缺乏其他生物胺氧化酶，也可能是由于酶活性受到了發(fā)酵環(huán)境因素的限制，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵鯖魚(yú)中分離鑒定了1株組胺降解菌Pseudomonasazotoformansstrain V-TB-2-5，該菌為中溫菌，適合在中性偏酸、NaCl<3%的環(huán)境中生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究，確定該酶為金屬酶，最適溫度和pH值分別為30℃和7。對(duì)鯖魚(yú)進(jìn)行強(qiáng)化接種并發(fā)酵，組胺降解率可達(dá)40.7%，該菌具備在水產(chǎn)品中降低組胺的應(yīng)用前景?？梢?jiàn)，在傳統(tǒng)發(fā)酵鯖魚(yú)中增加具有組胺降解能力的產(chǎn)氮假單胞菌，可以有效地降低其組胺含量，對(duì)于提高發(fā)酵水產(chǎn)品的食用安全性有重要應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)將進(jìn)一步研究產(chǎn)氮假單胞菌的安全毒理學(xué)評(píng)估以及其對(duì)發(fā)酵水產(chǎn)品的感官、理化性質(zhì)及微生物群落的影響。