趙偉， 劉永輝， 章露露， 樊璐， 孟海軍， 張港港， 李琳， 王磊， 吳國(guó)良

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

核桃(JuglansregiaL.)是一種全球性的經(jīng)濟(jì)果樹，其種仁營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“超級(jí)食品”[1-2]。目前世界上主栽的核桃品種葉片、果皮多呈現(xiàn)綠色，種皮黃白色或黃褐色。中國(guó)核桃資源豐富，其中發(fā)現(xiàn)于太行山區(qū)域的紅瓤核桃，其果皮、種皮及枝葉均呈紅色，是核桃育種中稀有而珍貴的資源[3]。王克建等[4]研究表明，紅瓤核桃呈現(xiàn)紅色的主要原因是含有大量花青苷。李永洲等[5]通過UPLC-PDA-MS/MS定性和定量檢測(cè)方法確定了紅瓤核桃果皮和葉片中的主要花青苷類型。

花青苷是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的天然色素，屬于黃酮類化合物，在植物體內(nèi)，由于花青苷的含量、種類不同會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色[6-7]?；ㄇ嘬丈锖铣墒侵参镱慄S酮合成途徑的重要分支，目前大多數(shù)植物中花青苷通路中的合成酶及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被分離鑒定[8-11]。其中MYB轉(zhuǎn)錄因子可以在多種植物中調(diào)節(jié)花青苷的生物合成。MYB轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)龐大且功能多樣的家族，在所有真核生物中均有表達(dá)[12]。在擬南芥中，AtMYB113、AtMYB114、AtMYB75/PAP1和AtMYB90/PAP2基因調(diào)控花青苷生物合成[13]，而AtMYB123/TT2在種皮中調(diào)節(jié)原花青苷的合成與積累[14]。

近年來，關(guān)于MYB基因參與果樹花青苷代謝途徑的研究日益增多。例如，油桃中的PpMYB10主要調(diào)控其果皮花青苷的合成[15]，蘋果中MdMYB9和MdMYB11參與茉莉酸誘導(dǎo)花青苷生物合成網(wǎng)絡(luò)[16]，梨PyMYB10通過調(diào)控花青苷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而促進(jìn)花青苷的積累[17-18]。然而，MYB基因在紅瓤核桃花青苷生物合成與代謝中的功能和表達(dá)尚不清楚。本試驗(yàn)基于紅瓤核桃和普通綠核桃不同發(fā)育時(shí)期果皮的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，對(duì)篩選獲得的兩個(gè)差異表達(dá)MYB基因進(jìn)行同源克隆與生物信息分析，探究其在紅、綠核桃內(nèi)種皮及紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片(紅葉和綠葉)中的表達(dá)情況，進(jìn)一步通過亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性分析驗(yàn)證其功能，為探明MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控紅瓤核桃花青苷的生物合成機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的植物材料為普通綠核桃‘中林一號(hào)’、紅瓤核桃(JuglansregiaL. accession ‘RW-1’)內(nèi)種皮及紅瓤核桃2 a生自然雜交后代不同表型的紅葉和綠葉，均定植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹資源圃。依照紅葉顏色變化過程，分別于葉片發(fā)育早期 (即幼葉期(2019-04-06)， 葉片全紅色)、葉片發(fā)育中期(即新梢旺長(zhǎng)、果實(shí)迅速膨大期(2019-05-29)，葉片紅綠相間)、葉片發(fā)育后期(即果實(shí)成熟早期(2019-06-21)，葉片成熟近于老化，趨于全綠色)采集紅瓤核桃自然雜交后代性狀分離的紅、綠核桃葉片；在開花(2019-04-18)后60、90和120 d采集兩種核桃的內(nèi)種皮。取樣后經(jīng)液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

選用本氏煙草(NicotianatabacumL.)作為亞細(xì)胞定位的植物材料，在溫度22 ℃、濕度60%、光照每天16 h的條件下, 培養(yǎng)5～6周后，用于試驗(yàn)。

1.2 RNA提取與cDNA合成

分別取普通綠核桃和紅瓤核桃內(nèi)種皮及紅瓤核桃自然雜交后代不同表型紅、綠葉片，經(jīng)液氮速凍研磨后，采用改良的CTAB法分別提取普通綠核桃與紅瓤核桃的內(nèi)種皮及紅瓤核桃自然雜交后代不同表型紅、綠葉片總RNA[19]。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照Fast Quant RT One-Step gDNA Removal(TransGen，北京)說明書合成第一鏈cDNA，以備后續(xù)基因克隆和qRT-PCR分析。

1.3 JrMYBs基因CDS序列克隆

通過河南農(nóng)業(yè)大學(xué)核桃育種課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]，篩選獲得2個(gè)差異表達(dá)MYB基因MYB4(LOC108981042)、MYB306(LOC108980474)。使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)特異引物，以紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片的cDNA為模板，克隆JrMYBs基因CDS序列，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL，其中KOD OneTMPCR Master Mix 25μL、 上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。

1.4 JrMYBs生物信息學(xué)分析

使用TBtools軟件對(duì)JrMYBs基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與染色體定位。運(yùn)用NCBI的Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析2個(gè)MYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并下載其他物種中的相似序列。通過DNAMAN和MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析。使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件分析2個(gè)MYB蛋白的氨基酸數(shù)、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)和總平均疏水性。在TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)分析。

1.5 JrMYBs亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)SE無縫克隆和組裝試劑盒(莊盟，北京)的說明書，利用同源重組和雙酶切(XbaI/KpnI)的方法將不含終止密碼子的JrMYB4/MYB306基因的ORF序列連接到含有GFP標(biāo)簽的pCAMBIA-super2300載體，構(gòu)建GFP融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)載體。參照賀丹等[20]的方法，將測(cè)序檢驗(yàn)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101后注射煙草葉片，培養(yǎng)3 d后取樣在蔡司LSM 710激光掃描顯微鏡(Carl Zeiss AG，德國(guó))下觀察GFP信號(hào)。

1.6 JrMYBs轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將JrMYB4/MYB306基因的ORF序列通過并雙酶切(NdeI/PstI)克隆到pGBKT7載體中，構(gòu)建。將包括pGADT7-T+pGBKT7-Lam(陰性對(duì)照)和pGADT7-T+pGBKT7-p53(陽(yáng)性對(duì)照)的重組質(zhì)粒通過LiAc介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold細(xì)胞中，詳細(xì)步驟參照王磊[21]的方法，最終在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-Gal缺陷培養(yǎng)基上點(diǎn)斑檢測(cè)轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.7 JrMYBs基因在紅、綠核桃不同組織發(fā)育過程中的表達(dá)分析

采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(Vazyme，南京)于ABI(Applied Biosystems)7500 Fast檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析。以18 S rRNA(XM_019004991.1)作為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法分析JrMYBs基因不同核桃內(nèi)種皮及紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片發(fā)育過程中的表達(dá)水平。引物由Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 核桃MYB基因克隆、表達(dá)及功能分析所用引物Table 1 The primers used in walnut MYB gene cloning,

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的采集和計(jì)算均設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)。其中，利用IBM統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 17.0和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn) (P<0.05) 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrMYBs基因的克隆和序列分析

根據(jù)PCR特異性引物，以紅瓤核桃自然雜交后代子代紅核桃和綠核桃葉片cDNA為模板，通過同源克隆獲得核桃2個(gè)MYB基因JrMYB4和JrMYB306的CDS序列(圖1-a)。JrMYB4和JrMYB306的全長(zhǎng)CDS序列分別為846和1 047 bp。內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，JrMYB4含有2個(gè)內(nèi)含子，而JrMYB306僅含有1個(gè)內(nèi)含子(圖1-b)。根據(jù)核桃基因組對(duì)2個(gè)核桃JrMYBs基因進(jìn)行染色體定位分析顯示，JrMYB4定位于1號(hào)染色體上，而JrMYB306定位于3號(hào)染色體上(圖1-c)。

a：JrMYB4和JrMYB306基因的CDS序列克隆。M：DL 2 000；1、3：以紅瓤核桃自然雜交后代綠葉為模板分別擴(kuò)增基因JrMYB4和JrMYB306產(chǎn)物；2、4：以紅瓤核桃自然雜交后代紅葉為模板分別擴(kuò)增基因JrMYB4和JrMYB306產(chǎn)物。b：2個(gè)JrMYB基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。c：2個(gè)JrMYB基因染色體定位。

2.2 JrMYBs蛋白序列分析

對(duì)JrMYB4和JrMYB306進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖2-a、2-b)，JrMYB4轉(zhuǎn)錄因子N端含有典型的R2R3-MYB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，而JrMYB306轉(zhuǎn)錄因子含有R3-MYB結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JrMYB4和JrMYB306轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列在紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片之間均無差異，且JrMYB4蛋白序列與其他物種中花青苷生物合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子相似性較大，而JrMYB306在N端R2-MYB保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生了缺失突變。蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖2-c、2-d)，JrMYB4和JrMYB306蛋白均不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

a：核桃JrMYB4與其他物種MYB蛋白序列比對(duì)。MYB4：紅瓤核桃自然雜交后代紅葉中MYB4蛋白序列；JrMYB4：紅瓤核桃自然雜交后代綠葉中MYB4蛋白序列。b：核桃JrMYB306與其他物種MYB蛋白序列比對(duì)。MYB306：仁核桃自然雜交后代紅葉中MYB306蛋白序列；JrMYB306：紅瓤核桃自然雜交后代綠葉中MYB306蛋白序列序列。c、d：分別為核桃JrMYB4和JrMYB306蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

利用ProtParam tool在線工具分析顯示(表2)，JrMYB4蛋白由281個(gè)氨基酸組成，化學(xué)分子式為C1395H2125N383O439S13，理論等電點(diǎn)pI為5.11，相對(duì)分子質(zhì)量為31.70 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為64.82(>50)，脂肪系數(shù)為63.24，總負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)為35，總正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為25。JrMYB306蛋白由348個(gè)氨基酸組成，化學(xué)分子式為C1395H2125N383O439S13，理論等電點(diǎn)為5.62，相對(duì)分子質(zhì)量分別為38.25 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為51.60(>50)；脂肪系數(shù)為69.52；總負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)為38；總正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為41。此外，兩個(gè)JrMYBs的總平均疏水指數(shù)(GRAVY)均為負(fù)值，故均為親水性蛋白。

表2 JrMYBs蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of

續(xù)表 Continuing table

2.3 JrMYBs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用2個(gè)JrMYB蛋白與擬南芥(Arabidopsisthaliana，AtMYB3、AtMYB4、AtMYB12、AtMYB113、AtMYB114、AtPAP1、AtPAP2、AtTT2)、玉米(Zeamays，ZmMYBC1、ZmPI)、蘋果(Malusdomestica，MdMYB1、MdMYB10、MdMYB17)、葡萄(Vitisvini-fera，VvMYB5a、VvMYBA1、VvMYBA2、VvMYBA7)、桃(Prunuspersica，PpMYB10、PpMYB16、PpMYB111)、草莓(Fragariaxananassa,FaMYB1、FaMYB10、FvMYB10)、桑樹(Morusnotabilis，MnMYB4、MnMYB308、MnMYB330)、楊樹(Populustrichocarpa，PtrMYB182)、柿(Diospyroskaki，DkMYB14、DkMYB15)、煙草(Nicotianatabacum，NtMYB2)、矮牽牛(Petuniahybrida，PhAN2)、胡蘿卜(Daucuscarota，DcMYB1)等12個(gè)物種的32個(gè)花青苷合成相關(guān)MYB蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3結(jié)果表明，核桃JrMYB4和JrMYB306蛋白均與MnMYB4、NtMYB2和DcMYB1親緣關(guān)系較近。

AtMYB3(NP_195225)、AtMYB4(AAS10085)、AtMYB12(ABB03913)、AtMYB113(NP_176811)、AtMYB114(NP_176812)、AtPAP1(ABB03879)、AtPAP2(NP_176813)、AtTT2(NP_198405)DcMYB1(BAE54312)、DkMYB14(AVR54519)、DkMYB15(AVR54520)、FaMYB1(AAK84064)、FaMYB10(ABX79947)、FvMYB10(ABX79948)、MdMYB1(XP_028963316)、MdMYB10(DQ267896)、MdMYB17(ADL36757)、MnMYB4(XP_010107438)、MnMYB308(XP_010090332)、MnMYB330(XP_010104477)、NtMYB2(BAA88222)、PhAN2(ABO21074)、PpMYB10(ABX79945.1)、PpMYB16(ppa010277m)、PpMYB111(ppa010716m)、PtrMYB182(XP_002305872)、VvMYB5a(NP_001268108)、VvMYBA1(XP_010664911)、VvMYBA2(BAD18978)、VvMYBA7(ACI96116)、ZmMYBC1(AAA33482)、ZmPl(AAA19821)

2.4 核桃JrMYB4和JrMYB306基因在紅、綠核桃不同組織發(fā)育過程中的表達(dá)分析

為探究JrMYB4和JrMYB306基因在紅瓤核桃花青苷合成中的表達(dá)模式，對(duì)普通綠核桃與紅瓤核桃內(nèi)種皮以及紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片(紅葉和綠葉)發(fā)育過程中的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析(圖4)。結(jié)果表明，對(duì)于普通綠核桃與紅瓤核桃內(nèi)種皮，JrMYB4在各時(shí)期紅瓤核桃的表達(dá)量均高于普通綠核桃，而JrMYB306除在第1時(shí)期普通綠核桃中的表達(dá)量高于紅瓤核桃外，在第2、3時(shí)期紅瓤核桃中的表達(dá)量均顯著較高。對(duì)于紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片，JrMYB4和JrMYB306的表達(dá)模式相似，均在第1、3時(shí)期的紅葉中顯著高于綠葉，而在第2時(shí)期二者的表達(dá)水平均表現(xiàn)為在紅葉中較低。對(duì)于各組織不同發(fā)育時(shí)期，JrMYB4和JrMYB306在紅瓤核桃內(nèi)種皮中的表達(dá)量均呈持續(xù)上調(diào)趨勢(shì)，而在普通綠核桃中JrMYB4的表達(dá)量逐漸下降，JrMYB306呈先上升后下降的趨勢(shì)；JrMYB4和JrMYB306在紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片中的表達(dá)量均呈先下降后上升的趨勢(shì)，而JrMYB4在綠葉中的表達(dá)量逐漸下降，JrMYB306呈先下降后上升的趨勢(shì)。

在同一時(shí)期的不同表型組織之間進(jìn)行顯著性差異比較。* P<0.05。

2.5 JrMYB4和JrMYB306亞細(xì)胞定位分析

為探究JrMYB4和JrMYB306在細(xì)胞中發(fā)揮功能的場(chǎng)所，分別將JrMYB4和JrMYB306基因的ORF序列構(gòu)建到pCAMBIA-2300-35S-GFP載體上，并將重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片。結(jié)果顯示(圖4)，空載pCAMBIA2300-GFP在整個(gè)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均能檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，而在含有35 S::JrMYB4-GFP和35 S::JrMYB306-GFP載體的細(xì)胞中均僅在細(xì)胞核中檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明JrMYB4和JrMYB306轉(zhuǎn)錄因子均定位于細(xì)胞核上，在細(xì)胞核中發(fā)揮功能作用(圖5)。

GFP：綠色熒光蛋白；BF：明場(chǎng)；Merge：混合場(chǎng)；標(biāo)尺為38.5和20 μm。

2.6 JrMYB4和JrMYB306轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將JrMYB4和JrMYB306基因的ORF序列分別構(gòu)建到酵母pGBKT7載體中，獲得JrMYB4-BD和JrMYB306-BD的融合載體，轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H后，在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-Gal四缺培養(yǎng)基上點(diǎn)斑培養(yǎng)。如圖6所示，轉(zhuǎn)化JrMYB4和JrMYB306的培養(yǎng)基上均有菌斑生長(zhǎng)，其中JrMYB4顯色較強(qiáng)，而JrMYB306顯色較弱，表明二者均具有轉(zhuǎn)錄激活活性，但JrMYB306的活性較弱。

NC：陰性對(duì)照，pGADT7-T+pGBKT7-Lam；PC：陽(yáng)性對(duì)照，pGADT7-T+pGBKT7-p53；MYB4：pGADT7-T+pGBKT7-JrMYB4；MYB306：pGADT7-T+pGBKT7-JrMYB306。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過紅瓤核桃與普通綠核桃果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得2個(gè)差異顯著表達(dá)的MYB基因?yàn)镴rMYB4和JrMYB306。對(duì)基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析，JrMYB4的氨基酸序列N端含有典型R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域，而JrMYB306的氨基酸序列僅存在R3型結(jié)構(gòu)域。R2R3型MYB基因是眾多調(diào)節(jié)基因中促進(jìn)或抑制花青苷合成最重要的一類基因[22]，當(dāng)R保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后可能引起轉(zhuǎn)錄因子的功能改變，即促進(jìn)或抑制下游代謝途徑中功能結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量[23]。JrMYB306的N端R2保守結(jié)構(gòu)域缺失，這種突變可能就是核桃花青苷積累的關(guān)鍵原因，在獼猴桃中有類似的結(jié)果[24]。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，JrMYB4和JrMYB306的蛋白序列與花青苷合成相關(guān)的桑樹(Morusnotabilis)MnMYB4[25]、煙草(Nicotianatabacum)NtMYB2[26]和胡蘿卜(Daucuscarota)DcMYB1[27]具有較高的相似性。

對(duì)2個(gè)JrMYB基因在不同顏色核桃不同組織發(fā)育過程中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)JrMYBs在不同顏色核桃組織各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平較為相似。JrMYB4和JrMYB306在紅瓤核桃內(nèi)種皮花青苷合成過程中3個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)量均逐漸上升且均在第2、3時(shí)期顯著高于普通綠核桃；在紅瓤核桃自然雜交后代不同表型葉片中，JrMYB4和JrMYB306均在顏色差異最大和基本保持穩(wěn)定的的第1、3時(shí)期紅葉中表達(dá)量顯著較高，表明2個(gè)JrMYB基因的表達(dá)水平均與紅瓤核桃顏色表型變化及其花青苷含量存在正相關(guān)關(guān)系，可能是正向調(diào)控花青苷合成與積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，JrMYB4和JrMYB306均定位于細(xì)胞核上，這與大部分的轉(zhuǎn)錄因子定位結(jié)果一致[28-29]。轉(zhuǎn)錄因子激活活性分析結(jié)果顯示，JrMYB4具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，而JrMYB306的轉(zhuǎn)錄激活活性較弱，這可能與其結(jié)構(gòu)域缺失有關(guān)。已有研究表明，梨中PpMYB17轉(zhuǎn)錄因子通過激活類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)而正向調(diào)控果實(shí)中黃酮類化合物的合成與積累，分析發(fā)現(xiàn)PpMYB17是一個(gè)核蛋白且具有轉(zhuǎn)錄自激活活性[30]。

本研究初步推斷JrMYB4和JrMYB306為紅瓤核桃花青苷生物合成相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因，并為進(jìn)一步驗(yàn)證其在花青苷合成與積累方面的作用奠定了基礎(chǔ)。