女貞子提取物預(yù)防產(chǎn)蛋后期蛋雞脂肪肝的研究

李曉麗， 何萬(wàn)領(lǐng)，2， 王毅博， 李旺， 丁軻， 馬彥博， 李元曉， 曹平華， 趙龍妹

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.河南省生物發(fā)酵微量元素及安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，河南 鶴壁 456250)

脂肪肝綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLS)是蛋雞集約化籠養(yǎng)過(guò)程中最常見的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病[1-2]。據(jù)調(diào)查，中國(guó)蛋雞FLS發(fā)生率高達(dá)30%以上，且多發(fā)生于產(chǎn)蛋期雞群，同時(shí)導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降幅度高達(dá)60%，給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。FLS作為制約蛋雞養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素，長(zhǎng)期以來(lái)在實(shí)際生產(chǎn)中尚無(wú)有效措施對(duì)其進(jìn)行控制和預(yù)防。女貞子是木犀科常綠喬木女貞(LigustrumlucidumAit)的成熟果實(shí)，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[4-5]，具有滋補(bǔ)肝腎、調(diào)理肝功能等作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，女貞子能明顯降低糖尿病和高脂誘導(dǎo)的大鼠血液和肝中甘油三酯(total glyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)以及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)的濃度，減少肝脂肪沉積[7-8]。作者前期研究也證實(shí)，以女貞子為主成分的復(fù)合中草藥添加劑能夠降低蛋雞血清中TG和TC濃度[9]。以上結(jié)果表明，女貞子及其提取物在蛋雞FLS預(yù)防上具有廣闊的應(yīng)用前景。為此，本試驗(yàn)通過(guò)在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加不同含量的女貞子提取物(Ligustrumlucidumextract, LLE)研究其對(duì)蛋雞脂肪肝的預(yù)防效果及可能機(jī)制，為女貞子提取物在預(yù)防蛋雞FLS的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

女貞子于2018年10月采自河南科技大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)。將女貞子于70 ℃中干燥，保存于通風(fēng)干燥處備用。LLE的提取參考高亮亮等[10]的方法。提取物活性成分采用高效液相色譜儀(Waters2695，美國(guó))測(cè)定，其中LLE中女貞多糖含量155 g·kg-1，齊墩果酸含量13.2 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧組成

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將體質(zhì)量均勻、健康的360只500日齡海蘭褐蛋雞(Hy-Line Brown laying hens)隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只，試驗(yàn)期30 d。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組為高能低蛋白日糧試驗(yàn)組，分別在日糧中添加0、500、1 000、1 500、2 000 mg·kg-1的LLE?；A(chǔ)飼糧組成及其營(yíng)養(yǎng)成分見表1。其中，預(yù)混料為1 kg飼糧中包含維生素A 7 500 IU、維生素D32 500 IU、維生素E 35 mg、維生素K31 mg、維生素B11.5 mg、維生素B24 mg、維生素B62 mg、維生素B120.02 mg、煙酸30 mg、葉酸0.55 mg、泛酸10 mg、生物素0.16 mg、氯化膽堿420 mg、鐵元素64 mg、鋅元素72 mg、銅元素15 mg、錳元素85 mg、碘元素0.4 mg。

1.3 飼養(yǎng)管理

采用3層階梯籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)3只雞。采用人工光照和自然光照相結(jié)合的方法，每天光照17 h。試驗(yàn)蛋雞自由采食，采用乳頭式飲水器自由飲水。每天6:30和17:30分別上料1次，采用自由采食和飲水，參照免疫程序防疫，定期清理糞便并維護(hù)環(huán)境衛(wèi)生。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)30 d后每組重復(fù)取6只雞，禁食12 h后空腹稱雞體質(zhì)量，并進(jìn)行翅下靜脈采血，3 000 r·min-1離心10 min，制備血漿，-20 ℃凍存。將蛋雞麻醉處死，取出整個(gè)肝，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙擦干稱質(zhì)量。剝離試驗(yàn)雞的腹部脂肪及肌胃周圍脂肪后稱質(zhì)量。取5 mm肝組織塊，置于體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液中固定，用于肝病理檢查。取1 mm3的肝組織塊，置于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中固定，用于透視電鏡(Talos F200X S/TEM，Thermo Fisher)觀察肝的超微結(jié)構(gòu)變化。其余肝組織用錫箔紙包裝，-20 ℃液氮速凍備用。試驗(yàn)符合動(dòng)物倫理要求及動(dòng)物福利法相關(guān)規(guī)定。

肝勻漿制備方法：稱取肝組織2 g，加入9倍體積生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，12 000 r·min-1離心5 min(M1324R，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，取上清液待測(cè)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 肝指數(shù)、肝脂率及腹脂率指標(biāo)測(cè)定 參照邢玉娟等[11]的方法，稍作修改。雞解剖后，將肝和腹部脂肪完整取出，稱質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)和腹脂率；取部分肝，烘干并研磨，采用索氏化學(xué)抽提法測(cè)定肝脂率。為消除樣品前處理過(guò)程中水分損失造成的誤差，本研究以抽提脂肪質(zhì)量占風(fēng)干樣品質(zhì)量(65 ℃烘干15 h)的比例作為肝脂肪含量指標(biāo)。

肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

(1)

肝脂率=(提取前濾紙包干質(zhì)量-提取后濾紙包干質(zhì)量)/(提取前濾紙包干質(zhì)量-濾紙干質(zhì)量)×100%

(2)

腹脂質(zhì)量=腹部脂肪質(zhì)量+肌胃周圍的脂肪質(zhì)量

(3)

腹脂率=腹脂質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%

(4)

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Basic diet and its nutritional ingredients (air-dry basis)

1.5.2 血清和肝抗氧化指標(biāo) 采用比色法測(cè)定血清和肝中總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性，采用羥胺法測(cè)定血清和肝中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測(cè)定血清和肝中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。肝組織蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，具體操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.5.3 血清和肝脂質(zhì)代謝指標(biāo) 采用賴氏法測(cè)定血清和肝中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性，采用甘油三酯測(cè)定試劑盒(GPO-PAP法)和總膽固醇試劑盒(COD-PAP法)測(cè)定血清和肝中TG和TC濃度。肝組織蛋白濃度的測(cè)定方法同上。

1.5.4 肝組織切片制備及病理學(xué)觀察 在肝最大葉距邊緣5 mm處切取小片肝組織塊，立即固定于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液和體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中，進(jìn)行常規(guī)脫水包埋，采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，用光學(xué)顯微鏡觀察肝脂肪病變(×400)；用電子顯微鏡觀察肝組織線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)的變化(×5 000)。切片制作均在武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0中的單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值的多重比較采用Duncan’s法進(jìn)行，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝指數(shù)、肝脂率及腹脂率的影響

由表2可知，與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組肝指數(shù)、腹脂率及肝脂率分別顯著升高了54.02%、170.41%和181.60%，LLE能夠降低以上指標(biāo)。與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組肝指數(shù)和肝脂率分別顯著降低了40%和30.65%、42.61%和29.21%、46.67%和31.74%、45.51%和32.6%，試驗(yàn)Ⅲ組和Ⅴ組腹脂率顯著降低了48.93%和47.04%。

表2 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝指數(shù)、肝脂率及腹脂率的影響Table 2 Effect of LLE on liver index, liver fat rate and abdominal fat rate of laying hens in late laying stage %

2.2 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、肝抗氧化能力的影響

由表3可知，在血清中，與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組GSH-PX含量顯著降低了9.91%，MDA含量顯著升高了80.57%，而SOD和T-AOC含量也有所降低，但不顯著。與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ組中GSH-PX含量顯著升高，試驗(yàn)Ⅴ組中MDA含量顯著降低；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組中SOD含量有所升高，試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組中T-AOC含量有所升高，但均不顯著。在肝中，與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組SOD、GSH-PX和T-AOC含量分別顯著降低了31.06%、25.42%和23.84%，而MDA含量顯著升高了69.49%。與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅴ組中SOD含量顯著升高，試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ組中GSH-PX含量顯著升高，試驗(yàn)Ⅴ組中T-AOC含量顯著升高，而試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組中MDA含量顯著降低。

表3 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、肝抗氧化能力的影響Table 3 Effect of LLE on the serum and antioxidant capacity of liver of layers in late laying period

2.3 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、肝脂質(zhì)代謝的影響

由表4可知，與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組血清ALT含量顯著升高了151.16%，TG、TC和AST含量有所上升，但差異不顯著；與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅴ組中血清AST含量顯著降低，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組中血清ALT含量顯著降低；與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組中TG、TC含量有所降低，但差異不顯著。與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組肝TG、TC、AST和ALT含量分別顯著升高了57.54%、36.55%、26.65%和59.97%；LLE試驗(yàn)組肝各項(xiàng)脂質(zhì)指標(biāo)均有所下降，與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組中AST、ALT含量顯著降低，試驗(yàn)Ⅳ、Ⅵ組中TG含量顯著降低，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組中TC含量顯著降低。

表4 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、肝脂質(zhì)代謝的影響Table 4 Effects of LLE on serum and liver lipid metabolism of layers in late laying period mmol·L-1

2.4 女貞子提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝組織病理學(xué)觀察

由圖1可知，試驗(yàn)Ⅰ組肝外形正常，無(wú)脂肪沉積的黃染現(xiàn)象;試驗(yàn)Ⅱ組肝腫大，脂肪黃染現(xiàn)象明顯，并出現(xiàn)肝脆性增加，解剖時(shí)出現(xiàn)不易成型、易碎等現(xiàn)象；與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ組肝有黃染現(xiàn)象，但結(jié)構(gòu)成型性較好，試驗(yàn)Ⅴ組和試驗(yàn)Ⅵ組肝大小正常，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)脂肪沉積的黃染現(xiàn)象。由圖2可知，試驗(yàn)Ⅰ組肝細(xì)胞大小均勻，肝小葉、肝索結(jié)構(gòu)明顯存在，無(wú)肝細(xì)胞脂肪病變；試驗(yàn)Ⅱ組，大部分肝細(xì)胞腫大且胞質(zhì)疏松化，呈現(xiàn)重度空泡樣變性和氣球樣變性，形成大量的脂肪滴，肝小葉消失，肝索紊亂，僅存在少量的正常肝細(xì)胞，胞核位于中央或被擠到一側(cè)；與試驗(yàn)Ⅱ組相比較，LLE添加組(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組)均表現(xiàn)出不同程度的緩解，肝細(xì)胞脂肪變性及脂肪滴數(shù)量減少，部分肝索排列紊亂，當(dāng)LLE添加量為1 500 mg·kg-1(Ⅴ組)時(shí)，肝脂肪病變得到有效緩解，無(wú)空泡樣變性。

注：Ⅰ基礎(chǔ)日糧組；Ⅱ～Ⅵ高能低蛋白日糧試驗(yàn)組(分別添加0、500、1 000、1 500和2 000 mg·kg-1女貞子提取物)。下同。

注：箭頭所指為空泡樣變性。下同。

由圖3可知，試驗(yàn)Ⅰ組在電鏡下肝細(xì)胞中線粒體遍布胞質(zhì)，呈橢圓形或圓形，線粒體膜和基質(zhì)明顯，線粒體嵴稠密，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)中未見脂滴，且含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，核膜連續(xù)且染色質(zhì)分顯，并出現(xiàn)肝脆性增加，解剖時(shí)出現(xiàn)不易成型、易碎等現(xiàn)象；與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ組和Ⅳ組肝有黃染現(xiàn)象，但結(jié)構(gòu)成型性較好，試驗(yàn)Ⅴ組和試驗(yàn)Ⅵ組肝大小正常，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)脂肪沉積的黃染現(xiàn)象。由圖2可知，試驗(yàn)Ⅰ組肝細(xì)胞大小均勻，肝小葉、肝索結(jié)構(gòu)明顯存在，無(wú)肝細(xì)胞脂肪病變；試驗(yàn)Ⅱ組大部分肝細(xì)胞腫大、胞漿疏松化，呈現(xiàn)重度空泡樣變性和氣球樣變性，形成大量的脂肪滴，肝小葉消失，肝索紊亂，僅存在少量的正常肝細(xì)胞，胞核位于中央或被擠到一側(cè)；與試驗(yàn)Ⅱ組相比較，LLE添加組(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組)均表現(xiàn)出不同程度的緩解，肝細(xì)胞脂肪變性及脂肪滴數(shù)量減少，部分肝索排列紊亂，當(dāng)LLE添加量為1 500 mg·kg-1(Ⅴ組)時(shí)，肝脂肪病變得到有效緩解，無(wú)空泡樣變性。

注： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；線粒體；脂滴; 核糖體。

3 結(jié)論與討論

蛋雞有為能而食的天性，但過(guò)高的日糧能量會(huì)造成蛋雞機(jī)體組織器官的生理變化和脂質(zhì)積累[12]。研究表明，日糧能量與肝指數(shù)呈正比[13]。本研究結(jié)果表明，與10.82 MJ·kg-1代謝能的基礎(chǔ)日糧組相比，采用11.75 MJ·kg-1代謝能的日糧組蛋雞肝指數(shù)顯著升高。肝脂和腹脂是反映脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，較高的能量會(huì)促進(jìn)肝脂和腹脂的沉積[14-15]。本研究中，LLE添加組蛋雞肝指數(shù)、肝脂率和腹脂率顯著降低，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，表明LLE能夠促進(jìn)蛋雞脂質(zhì)代謝，降低蛋雞脂肪肝發(fā)生。

蛋雞在正常情況下，肝脂質(zhì)合成與輸出保持平衡，疏泄有度，脂質(zhì)不會(huì)在肝發(fā)生明顯的沉積。但是，當(dāng)肝脂肪來(lái)源多于脂肪輸出時(shí)，過(guò)多的脂肪便沉積于肝細(xì)胞內(nèi)。這是因?yàn)榈半u長(zhǎng)期飼喂高能低蛋白，肝將多余能量轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)，運(yùn)送出血液或相應(yīng)器官，而肝中合成脂蛋白或載脂蛋白的蛋白質(zhì)不足，使其轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，破壞了肝細(xì)胞、脂肪和血液之間脂肪代謝的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致以中性脂肪為主的脂質(zhì)在肝細(xì)胞過(guò)度沉積[26]。研究表明，LLE中的苯丙烷類糖苷成分可以降低血漿和肝中的TG和TC濃度[27]。馬得瑩等[28]研究發(fā)現(xiàn)女貞子有降低血清中TC濃度的趨勢(shì)。王環(huán)宇[24]研究表明，女貞子萃取物可顯著增加肉仔雞血清中高密度脂蛋白含量，降低TC濃度和低密度脂蛋白含量，并有降低ALT和AST活性的趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高能低蛋白質(zhì)飼糧中添加LLE可以改善蛋雞脂質(zhì)代謝，降低血清和肝中TC、TG的濃度以及ALT、AST的活性，這與上述研究結(jié)果相一致。該結(jié)果表明，LLE可緩解高能低蛋白日糧下蛋雞肝脂質(zhì)代謝負(fù)擔(dān)。

肝是蛋雞脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，機(jī)體幾乎全部脂肪是在肝中合成與代謝。但家禽肝儲(chǔ)存脂肪能力較低，較多的脂類物質(zhì)在肝中積累易造成一系列病理變化，如肝腫大、肝脂率增高、組織脂質(zhì)空泡變性及結(jié)構(gòu)損傷等[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在11.75 MJ·kg-1代謝能下，蛋雞肝腫大、黃染現(xiàn)象明顯，且肝結(jié)構(gòu)模糊；組織鏡檢發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中有大量空泡樣變性，細(xì)胞核周圍脂滴大量分布，線粒體損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為線粒體膜損傷、基質(zhì)減少或消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜損傷及腫大等病理變化，符合蛋雞脂肪肝綜合征特征[29-30]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間高能低蛋白飼喂會(huì)造成肝游離脂肪酸和TG的積累，從而增強(qiáng)線粒體的脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化過(guò)程[31]，而氧化和磷酸化的解偶聯(lián)以及氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化作用的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[32]。ROS的產(chǎn)生引起脂肪酸氧化障礙，造成脂肪集聚以及線粒體畸形、增大和嵴的喪失[33]。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，在高能低蛋白質(zhì)飼糧中，隨著LLE添加量增加，蛋雞肝腫大消失，顏色正常，鏡檢可見細(xì)胞脂肪變性得到有效緩解，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞單位損傷減少。這表明LLE能夠有效降低脂質(zhì)過(guò)氧化應(yīng)激，減少“二次”打擊對(duì)肝細(xì)胞的損害。飼糧中添加1 500 mg·kg-1的LLE可顯著促進(jìn)高能低蛋白飼糧下蛋雞脂質(zhì)代謝，降低血清、肝脂肪積累，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性，從而降低脂肪肝綜合征的發(fā)生率。