張晨曦， 賴(lài)云強(qiáng)， 楊嵐， 樊學(xué)偉， 王陽(yáng)光， 李文婷， 康相濤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046)

雞蛋作為蛋雞產(chǎn)業(yè)的主要產(chǎn)品，是人類(lèi)攝取動(dòng)物蛋白的主要來(lái)源之一，而產(chǎn)蛋量是蛋雞生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟(jì)性狀[1-2]。蛋雞繁殖性能與卵巢等器官發(fā)育密切相關(guān)，直接影響產(chǎn)蛋量[3]，因此，對(duì)卵巢發(fā)育相關(guān)基因克隆及分析將有助于蛋雞育種工作。目前，中國(guó)家禽育種選留工作處于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合的階段[4]，許多研究者通過(guò)分子生物學(xué)方法發(fā)掘相關(guān)基因功能，包括基因克隆、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及分子生物信息學(xué)分析等。利用這些技術(shù)探究基因結(jié)構(gòu)和功能，將為后續(xù)深入研究基因參與調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制提供重要理論參考。

卵泡生長(zhǎng)發(fā)育直接影響產(chǎn)蛋量，受自分泌和旁分泌因子調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorsβ，TGF-β)家族通過(guò)自分泌方式作用于顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育[5-8]，其家族成員包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factors，GDFs)、活化素、抑制素等。BMPR1B基因是影響綿羊多羔的主效基因，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[9]，且該基因所編碼的蛋白是多種BMPs的受體，在卵泡發(fā)育、生長(zhǎng)和免疫等方面扮演重要角色，與動(dòng)物的繁殖密切相關(guān)[10-12]。BMPR1B蛋白與TGF-β家族成員中的BMP15蛋白特異性結(jié)合后，形成BMP配體復(fù)合物，磷酸化后激活Ⅰ型受體，通過(guò)Smad1/5/8磷酸化作用影響顆粒細(xì)胞分泌孕酮從而調(diào)控卵泡發(fā)育，進(jìn)而影響產(chǎn)蛋率[13-14]。此外，BMP15作為其配體在參與雞卵泡的選擇過(guò)程，與雞的產(chǎn)蛋性狀密切相關(guān)[15-16]。目前，關(guān)于BMP基因以及BMPR1B基因的研究主要集中在羊上，并將其作為多羔候選基因進(jìn)行探究[17-19]，并判定其主要功能是影響動(dòng)物卵巢的排卵。然而，BMPR1B基因在家禽中相關(guān)研究較少。本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆獲得雞BMPR1B基因cDNA序列，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)雞BMPR1B基因在各組織中的表達(dá)，為BMPR1B基因在分子水平上的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選取43周齡太行雞(太行雞保種場(chǎng))6只，飼養(yǎng)于相同條件下。頸部放血處死后，采集6～8 mm小黃卵泡及整個(gè)卵巢組織，同時(shí)取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織，迅速置于液氮中冷凍，之后保存于-80 ℃冰箱備用。試驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理要求及動(dòng)物福利法相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzolTMReagent 試劑、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；DNase/RNase-free去離子水、2×Taq PCR Master Mix(北京康為世紀(jì)生物公司)；DNA 純化回收試劑盒、pMD18-T 載體、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)、KOD One TM PCR Master Mix(東洋紡(上海)生物科技有限公司)、RACE試劑盒(takara)。

普通PCR 儀(PowerCycle，德國(guó) Eppendorf 公司)；qRT-PCR儀(LightCycler96，瑞士Roche公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Neofuge 23R，美國(guó) Thermo 公司)；超低溫冰箱(MF-U53869，日本Panasonic公司)；電泳儀(DYY-Ⅲ型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GBOX EF，英國(guó) SYNGENE 公司)；分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國(guó)Thermo公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)上雞BMPR1B的參考基因序列(NM_205132.1)，使用Primer5.0設(shè)計(jì)基因克隆特異性引物和熒光定量PCR引物(表1)。引物設(shè)計(jì)完成后均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 BMPR1B基因引物信息Table 1 Primer information of BMPR1B gene

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol法[20]提取組織的總RNA，溶于DNase/RNase-free H2O，通過(guò)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)得到cDNA，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 雞BMPR1B基因克隆 以小黃卵泡組織的cDNA為模板，擴(kuò)增BMPR1B基因的編碼序列(coding sequence, CDS)區(qū)，擴(kuò)增體系為：25 μL KOD One TM PCR Master Mix，BMPR1B-F 0.5 μL，BMPR1B-R 0.5 μL，cDNA 1 μL，去離子水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 預(yù)變形3 min； 98 ℃變性10 s，65 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 繼續(xù)延伸5 min。擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒回收后進(jìn)行測(cè)序。

以測(cè)序得到的CDS序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)雞BMPR1B基因5’ RACE與3’ RACE的特異性引物，利用RACE試劑盒克隆其5’端(5’UTR)和3’端(3’UTR)序列。以5’ RACE為例，具體擴(kuò)增體系：1)一輪巢式PCR：cDNA 2.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，UPM (10×) Primer 5 μL，BMPR1B-5R-521R 1 μL，去離子水補(bǔ)至50 μL，PCR產(chǎn)物稀釋50倍；2)二輪巢式PCR: 一輪稀釋產(chǎn)物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-337R 1 μL，去離子水補(bǔ)至50 μL，PCR產(chǎn)物稀釋50倍；3) 三輪巢式PCR: 一輪稀釋產(chǎn)物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-165R 1 μL, 去離子水補(bǔ)至50 μL, PCR產(chǎn)物稀釋50倍。反應(yīng)程序：1)一輪巢式PCR：95 ℃預(yù)變形5 min，95 ℃變性30 s，89 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，79 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；2)二輪巢式PCR：95 ℃預(yù)變形5 min；95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min；3)三輪巢式PCR：95 ℃預(yù)變形5 min；95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18-T在16 ℃下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，選取陽(yáng)性片段的克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.4.3 雞BMPR1B基因生物信息學(xué)分析 利用不同生物信息學(xué)軟件對(duì)雞BMPR1B基因進(jìn)行如下分析，主要分為核苷酸序列的同源性比較和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、蛋白理化參數(shù)分析、蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)、磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(表2)。

表2 生物學(xué)信息分析軟件及項(xiàng)目Table 2 Softwares and projects of biological information analysis

1.4.4 雞BMPR1B基因組織表達(dá)分析 以雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胸肌、腿肌和卵巢組織的cDNA為模板，分析雞BMPR1B基因在各個(gè)組織中的表達(dá)。qRT-PCR的反應(yīng)體系：TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，DNase/RNase-free H2O 3 μL，cDNA 1 μL，BMPR1B-F3 0.5 μL，BMPR1B-R3 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。另外，通過(guò)SPSS22.0軟件中單因素方差分析法對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。數(shù)值表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用 GraphPad Prism8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞BMPR1B基因的克隆

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物對(duì)雞BMPR1B基因的CDS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)，與NCBI上雞BMPR1B基因的CDS區(qū)進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)所獲得的序列為目的基因序列。在所獲得的CDS序列基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行5’ RACE及3’ RACE。5’ RACE獲得擴(kuò)增條帶長(zhǎng)260 bp和430 bp左右，3’ RACE獲得長(zhǎng)度為620 bp左右的擴(kuò)增條帶(圖2)。測(cè)序分析后，5’ UTR存在2種轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度分別為248和77 bp。3’ UTR存在1種轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為168 bp。將5’ RACE和3’ RACE結(jié)果與CDS序列進(jìn)行拼接后，得到雞BMPR1B基因的2種轉(zhuǎn)錄本T1和T2，長(zhǎng)度分別為1 925和1 754 bp(圖3)。轉(zhuǎn)錄本T1包括5’ UTR 248 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp，轉(zhuǎn)錄本T2包括5’ UTR 77 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp。

圖1 雞BMPR1B 基因CDS 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

圖2 雞BMPR1B基因5’ RACE(左圖)、3’ RACE(右圖)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 5’RACE(left) and 3’ RACE (right)PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

2.2 雞BMPR1B基因核苷酸同源性分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

雞BMPR1B基因序列與不同物種比較結(jié)果顯示，雞與火雞、野鴨、大猩猩、家鼠、馬、山羊、家貓、牛、人和蛙的BMPR1B基因核苷酸序列同源性分別為99.60%、98.80%、91.63%、91.62%、93.63%、91.04%、86.85%、92.23%、91.43%和90.84%(表3)。進(jìn)化樹(shù)分析表明，雞BMPR1B基因在進(jìn)化過(guò)程中與火雞親緣關(guān)系最近(圖4)。

圖3 雞BMPR1B基因2種轉(zhuǎn)錄本Fig.3 Two transcripts of chicken BMPR1B gene

表3 雞與其他物種BMPR1B基因核苷酸序列比對(duì)Table 3 Alignment of BMPR1B gene nucleotide sequence

圖4 雞BMPR1B基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 雞BMPR1B基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)雞BMPR1B基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，其分子式為C2 505H3 959N691O747S33，包含7 935個(gè)原子，相對(duì)分子質(zhì)量為 56.77 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為7.51，含有20種氨基酸(表4)。其中，亮氨酸含量最高(9.8%)，色氨酸含量最低(1.4%)。氨基酸不穩(wěn)定性指數(shù)為 53.63，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；蛋白疏水性分析顯示，最大值為4.04，最小值為-2.83，平均親水性為-0.365，則該蛋白為親水性蛋白(圖5)，脂溶性指數(shù)為 81.95，表明該蛋白的流動(dòng)性較好。

表4 雞BMPR1B基因編碼蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of BMPR1B gene encoding protein chicken

2.4 雞BMPR1B基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線軟件對(duì)雞BMPR1B基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析。結(jié)果表明，該蛋白有1段跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽(圖6-A)，屬于跨膜蛋白(圖6-B)。通過(guò)PRABI在線軟件預(yù)測(cè)雞BMPR1B基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲4種類(lèi)型，分別占整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的35.46%、10.96%、3.39%和50.20%，即無(wú)規(guī)卷曲是該蛋白的主要結(jié)構(gòu)(圖6-C)。使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲為雞BMPR1B蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖6-D)。利用SMART軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在1段跨膜結(jié)構(gòu)域，位于第127～149個(gè)氨基酸；1個(gè)GS保守結(jié)構(gòu)域，位于第174～204個(gè)氨基酸(圖6-E)。

圖5 雞BMPR1B基因編碼蛋白疏水性分析

注：A：雞BMPR1B基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)：B：雞BMPR1B基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C：雞BMPR1B基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D：雞BMPR1B基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；E: 雞BMPR1B基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

2.5 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用NetPhos2.0在線軟件預(yù)測(cè)雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果表明，有1個(gè)絲氨酸(Ser)、1個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)可能成為蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)(圖7)。使用NETOGlyc3.1在線軟件預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)，存在2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(圖8)。該結(jié)果表明，磷酸化是雞BMPR1B基因編碼蛋白修飾后的主要方式之一。

圖7 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)

圖8 雞BMPR1B基因編碼蛋白潛在糖基化位點(diǎn)

2.6 雞BMPR1B基因組織表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)雞BMPR1B基因在雞的心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌和卵巢8個(gè)組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明，雞BMPR1B基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，以卵巢組織中顯著最高(P<0.05)，其次是肝臟、胸肌、腎臟、腿肌，隨后是心臟、脾臟(圖9)。

注：1.脾臟;2.心臟;3.肺臟;4.腿肌;5.腎臟;6.胸肌;7.肝臟;8.卵巢。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

BMPR1B基因通過(guò)與其配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，尤其在畜禽繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[21]，被認(rèn)為是卵泡發(fā)育和正常排卵的必要生長(zhǎng)因子[22]。本研究從雞的小黃卵泡組織中成功克隆了雞BMPR1B基因序列，并獲得了2種轉(zhuǎn)錄本T1和T2，長(zhǎng)度分別為1 925 bp和1 754 bp，編碼502個(gè)氨基酸。核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該基因與火雞的BMPR1B基因有較高的同源性，并且與火雞親緣關(guān)系最近，符合生物進(jìn)化特征。蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒l(fā)揮功能起關(guān)鍵作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)雞BMPR1B基因編碼蛋白存在1個(gè)跨膜區(qū)段，無(wú)信號(hào)肽，屬于跨膜蛋白。此外，該蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白存在單個(gè)跨膜區(qū)段和1個(gè)GS保守結(jié)構(gòu)域，位于第174～204個(gè)氨基酸處，該區(qū)域高度保守，是TGF-βI型受體活化的重要部位[24]，這與哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果相類(lèi)似。在哺乳動(dòng)物中，BMPR1B基因編碼蛋白包括N端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和C端細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(GS結(jié)構(gòu)域)3部分，其C端的GS結(jié)構(gòu)域是信號(hào)傳導(dǎo)的重要部位[25-26]。因此，在不同物種中，BMPR1B的信號(hào)傳導(dǎo)方式可能是相同的。此外，相關(guān)研究表明，BMPR1B基因編碼的蛋白受體以磷酸化方式活化，之后迅速作用于Smads信號(hào)蛋白，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[27-28]，這與本研究結(jié)果中預(yù)測(cè)其可能存在Ser、Thr和Tyr共4個(gè)磷酸化位點(diǎn)的結(jié)果相符合。本研究還發(fā)現(xiàn)，雞BMPR1B基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)卷曲為主，占整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的50.20%；其次是α-螺旋，占35.46%。該結(jié)果說(shuō)明該蛋白穩(wěn)定性不強(qiáng)。張?bào)闫G[29]在綿羊中發(fā)現(xiàn)BMPR1B基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)也是以無(wú)規(guī)卷曲為主，這與本研究結(jié)果類(lèi)似。一般認(rèn)為，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲是造成蛋白不穩(wěn)定的重要原因，且是蛋白分子功能實(shí)施及構(gòu)象的重要區(qū)域。因此，蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)對(duì)正確認(rèn)識(shí)基因的蛋白結(jié)構(gòu)及功能具有重要意義。

基因在不同組織的表達(dá)具有廣泛性和特異性，其表達(dá)受多種因素調(diào)控[30]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BMPR1B基因在動(dòng)物體內(nèi)的不同組織內(nèi)廣泛表達(dá)[31]，這與本研究結(jié)果相一致，即雞BMPR1B基因在雞的心、肝、脾、肺和卵巢等8個(gè)組織均有表達(dá)，且在卵巢表達(dá)量最高。卵巢是影響繁殖性狀及激素分泌的主要效應(yīng)器官[32]，其正常發(fā)育對(duì)家禽排卵非常重要，而本研究中BMPR1B基因在雞的卵巢中的高表達(dá)，說(shuō)明該基因在卵巢發(fā)育中發(fā)揮一定作用。在哺乳動(dòng)物和家禽中，BMP15作為卵母細(xì)胞釋放的特異性信號(hào)因子，通過(guò)與受體BMPR1B基因編碼蛋白組成 BMP復(fù)合物[14]，磷酸化 Smad 蛋白，激活 Smad1/5/8通路[33]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控卵泡的發(fā)育。因此，探究雞BMPR1B基因的遺傳結(jié)構(gòu)和蛋白功能為下一步研究BMPR1B基因在雞卵巢發(fā)育中的功能奠定了遺傳信息學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于提高禽類(lèi)的產(chǎn)蛋性能具有一定的借鑒意義。