小麥黑胚病抗性位點(diǎn)檢測(cè)研究進(jìn)展

李巧云，高闖，張芳芳，李俁佳，陳向果，高艷，唐建衛(wèi)，殷貴鴻

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心/省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

小麥黑胚病(black point disease)是指小麥籽粒胚部有褐色至黑色斑點(diǎn)的病害,嚴(yán)重時(shí)癥狀可能延伸至籽粒腹側(cè)及冠毛端，甚至引起籽粒皺縮[1-4]。該病害不僅影響小麥籽粒外觀品質(zhì)、降低小麥?zhǔn)召?gòu)級(jí)別，導(dǎo)致發(fā)芽率和出苗率下降[4-6],而且感病籽粒還會(huì)毒素污染[7-11]，直接影響用種安全和食品安全。因此，許多國(guó)家對(duì)小麥黑胚率有嚴(yán)格的規(guī)定，如澳大利亞倉(cāng)貯種子的黑胚率上限為5%[6]，GB 1351—2008規(guī)定，三等以上小麥不完善粒應(yīng)≤6%，其中，黑胚粒是小麥不完善粒的6種類型之一[12]。近年來(lái)，隨著小麥品種更新?lián)Q代、水肥條件改善以及小麥成熟期間氣候的變化，黑胚病呈現(xiàn)加重的趨勢(shì)，已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注[13-15]。種植抗病品種是防治黑胚病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。然而，目前中國(guó)生產(chǎn)上推廣的小麥品種普遍感黑胚病[4,13-14,16-17]，優(yōu)異抗黑胚病小麥種質(zhì)資源與實(shí)用分子標(biāo)記缺乏，阻礙了抗黑胚病小麥品種的育種進(jìn)程。本研究就小麥對(duì)黑胚病的抗性遺傳特點(diǎn)、抗性位點(diǎn)及候選基因檢測(cè)的研究進(jìn)行綜述，并對(duì)研究中存在的問(wèn)題進(jìn)行思考，以期為小麥黑胚病抗性遺傳研究提供參考，盡早開(kāi)發(fā)小麥抗黑胚病主效位點(diǎn)連鎖或共分離的分子標(biāo)記，促進(jìn)中國(guó)小麥抗黑胚病分子育種進(jìn)程。

1 黑胚病抗性遺傳特點(diǎn)、影響因素及抗源篩選研究現(xiàn)狀

1.1 小麥黑胚病抗性遺傳特點(diǎn)研究進(jìn)展

基因型、地點(diǎn)、年份的互作效應(yīng)對(duì)黑胚病發(fā)病率影響較大[4,18-20]。抗感病親本雜交組合F1的黑胚率介于兩親本之間[21]，F(xiàn)2群體單株的黑胚率呈現(xiàn)正態(tài)分布特點(diǎn)、并具有超親現(xiàn)象[17,22]，表明小麥對(duì)黑胚病的抗性是由多基因控制的。王絲雨等[23]用蓋鈞鎰和章元明的“主基因+多基因混合模型”分析方法對(duì)源于宛原白1號(hào)/山農(nóng)4143組合的F7代重組自交系(recombinant inbred line,RIL)群體進(jìn)行遺傳分析的結(jié)果表明，黑胚病抗性遺傳符合“4對(duì)主基因+加性-上位性多基因”模型。STATLER等[1]以硬粒小麥(Durum wheat)品種Leeds(R)與Golden Ball(S)為親本，構(gòu)建正交與反交的F1、F2、F3及回交群體，對(duì)上述遺傳群體的研究結(jié)果表明，小麥對(duì)黑胚病的抗性與母本影響無(wú)關(guān)。這些研究結(jié)果表明，小麥對(duì)黑胚病的抗性具有數(shù)量性狀的特點(diǎn)。

1.2 小麥黑胚病發(fā)生的影響因素研究進(jìn)展

在不考慮品種抗性差異的情況下，小麥黑胚病的發(fā)生主要受2個(gè)因素的影響。(1)致病菌：小麥黑胚病致病菌復(fù)雜，不同地區(qū)報(bào)道的致病菌不一致。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，鏈格孢 (Alternariaalternata)[24-27]、麥根腐平臍蠕孢 (Bipolarissorokiniana)[24,26-28]與鐮刀菌屬真菌 (Fusariumspp.)[10,24,29]是小麥黑胚病的主要致病菌。國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心小麥遺傳育種課題組從3個(gè)自然環(huán)境條件下收獲的感黑胚病小麥品系的感病籽粒上分離到21個(gè)真菌菌株，屬于11個(gè)真菌屬，經(jīng)過(guò)致病性鑒定，其中10個(gè)菌株引起黑胚率顯著增加，形態(tài)學(xué)鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，10個(gè)菌株屬于6個(gè)真菌屬中的8個(gè)真菌種，分別為A.alternata、B.sorokiniana、Bipolariscrotonis、Bipolariscoffeana、Curvulariaspicifera、Fusariumequiseti、Exserohilumrostratum和Epicoccumsorghinum，其重分離頻率為94.9%[26]。(2)環(huán)境因素：栽培措施如澆水、施肥的時(shí)期、次數(shù)等[30-33]以及籽粒灌漿期間的氣象因子如溫度、濕度、日照長(zhǎng)度等也對(duì)黑胚率產(chǎn)生較大的影響[18,34-35]。

小麥對(duì)不同黑胚病致病菌的抗性不同。CONNER等[36]對(duì)7個(gè)自然條件下篩選的抗黑胚病小麥品種分別接種A.alternata或B.sorokiniana，所有抗病材料，對(duì)A.alternata的抗性都強(qiáng)于感病對(duì)照，而只有3個(gè)品種對(duì)B.sorokiniana黑胚病抗性強(qiáng)于感病對(duì)照，同一品種由兩種菌引起的黑胚率差異顯著，B.sorokiniana引起的黑胚率在品系Fielder和Sinton顯著低于A.alternata、而在品系Glenlea顯著高于A.alternata。CONNER等[37]用5個(gè)硬紅粒小麥品種接種B.sorokiniana和A.alternata的研究結(jié)果明確了硬紅粒小麥對(duì)A.alternata和B.sorokiniana黑胚病的抗性不相關(guān)，對(duì)B.sorokiniana黑胚病與B.sorokiniana根腐病的抗性也不相關(guān)。LI等[20]研究結(jié)果也顯示，小麥對(duì)不同黑胚病致病菌的抗性不相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，同一小麥品系對(duì)不同黑胚病致病菌的抗性可能有不同的遺傳機(jī)制。

復(fù)雜的影響因素導(dǎo)致同一小麥材料在不同年度、不同地點(diǎn)間黑胚率變化較大，以自然大田條件收獲籽粒的黑胚率(自然黑胚率)為依據(jù)進(jìn)行抗性鑒定的結(jié)果經(jīng)常不一致[14,18-21]，給黑胚病抗性遺傳研究帶來(lái)一定的困難。

1.3 抗黑胚病小麥種質(zhì)篩選研究進(jìn)展

不同小麥品系對(duì)黑胚病的抗性差異明顯，黑胚率在0.1% 到79.3%之間[13-14,19-21,36,38-39]，小麥黑胚病的廣義遺傳力為0.45～0.78[14,17-18]，表明遺傳因素對(duì)小麥黑胚病抗性有較大貢獻(xiàn)。許多學(xué)者以自然黑胚率為依據(jù)開(kāi)展了抗黑胚病小麥種質(zhì)的篩選。王會(huì)偉等[13]于2003—2005年對(duì)河南省生產(chǎn)上大面積推廣和新選育的44個(gè)小麥品種(系)的黑胚病抗性進(jìn)行調(diào)查，篩選出豫優(yōu)1號(hào)、陜 229 等6個(gè)抗黑胚病小麥品系,占供試材料的13 .6%。LI等[14]對(duì)鄭州市種植的403份小麥品系進(jìn)行連續(xù)3 a(2010—2012)的調(diào)查，篩選出山農(nóng)4143、西農(nóng)979-5等36份高抗黑胚病小麥品系，占供試材料的8.9%。CONNER 等[37]報(bào)道了SWS21與 Bliss等3份抗黑胚病軟白春小麥品種(Soft white spring wheat)，這些抗病品種為小麥黑胚病抗性遺傳研究與抗病育種提供了寶貴的資源。但是，這些抗病小麥種質(zhì)大部分是以自然黑胚率為基礎(chǔ)篩選的，其抗病表型可能是環(huán)境中菌源不足或環(huán)境因素不利于產(chǎn)生黑胚癥狀的結(jié)果，有待于創(chuàng)造適宜發(fā)病環(huán)境條件進(jìn)行接菌鑒定的驗(yàn)證。

目前，較少見(jiàn)到通過(guò)接菌鑒定篩選抗黑胚病小麥材料的報(bào)道。從2010年開(kāi)始，國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心小麥遺傳育種課題組開(kāi)始小麥黑胚病的研究，首先以自然黑胚率為基礎(chǔ)篩選抗、感黑胚病小麥品系[14]，分離鑒定了河南省小麥黑胚病的10個(gè)主要致病菌株[26]，建立了小麥黑胚病接菌鑒定的方法，然后以鑒定的致病菌株和確定的鑒定方法，對(duì)以自然發(fā)病率為基礎(chǔ)篩選的抗病品系進(jìn)行多年的接菌鑒定，從165份自然條件下表現(xiàn)抗病的小麥品系中只鑒定到7份抗B.sorokiniana黑胚病品系[40]，抗病種質(zhì)的缺乏制約著抗黑胚病小麥育種的發(fā)展。

2 小麥黑胚病抗性位點(diǎn)及候選基因檢測(cè)研究進(jìn)展

2.1 小麥抗黑胚病位點(diǎn)分析研究

自20世紀(jì)30年代小麥黑胚病被報(bào)道以來(lái)[41]，至21世紀(jì)初，各國(guó)學(xué)者對(duì)小麥黑胚病的研究主要集中在致病菌分離[6,8,25-27,29]、危害[2,4-6,14]、影響因素[18,31-35,37,42]、防治[2-3,16]等方面，關(guān)于抗性位點(diǎn)的報(bào)道很少。2004年，LEHMENSIEK等[43]用2個(gè)普通小麥DH群體，即源于Sunco(R)×Tasman(S)的180個(gè)株系與源于Cascades (R)×AUS1408 (S)的104個(gè)株系，根據(jù)自然發(fā)病率定位了9個(gè)小麥抗黑胚病QTL (quantitative trait locus)，分別位于1D、2A、2B、2D、3D、4A、5A和7A(2)染色上，能解釋4%～18%的表型變異。隨后，CHRISTOPHER等[44]用源于Batavia (S)×Pelsart (R)的DH群體，TAH等[45]用4個(gè)抗黑胚病品系和1個(gè)感病品系構(gòu)建的F2群體驗(yàn)證源于抗病親本Sunco的QTL位點(diǎn)及其連鎖標(biāo)記的有效性，指出與2B染色體上QTL連鎖的SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記gwm319、wmc35、wmc154和gwm501，有望在抗黑胚病育種中得到應(yīng)用。然而，用上述標(biāo)記進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性太高或選擇率過(guò)低的矛盾，即用1～2個(gè)標(biāo)記能檢測(cè)出70%以上的抗病家系，但假陽(yáng)性率>50%；用3個(gè)標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)，假陽(yáng)性率<40%，但會(huì)有50%以上的抗病家系檢測(cè)不到[43]，所以在育種中的實(shí)用性不大。這可能是該抗病位點(diǎn)的效應(yīng)小、或者標(biāo)記與抗病位點(diǎn)連鎖距離遠(yuǎn)等原因造成的。

隨著新一代測(cè)序技術(shù)和芯片技術(shù)的成熟，基于單核苷酸(single nucleotide polymorphisms，SNP)多態(tài)性的基因分型方法逐步在小麥抗性位點(diǎn)定位中廣泛應(yīng)用[46]，小麥黑胚病抗性遺傳研究得到快速發(fā)展。

LIU等[17]用源于臨麥2號(hào)/中892的F6代RIL群體，結(jié)合3點(diǎn)3 a的黑胚率與90 K SNP芯片的基因型數(shù)據(jù)，定位了9個(gè)抗黑胚病QTL，分別位于2AL、2BL、3AL、3BL、5AS、6A、7AL (2)和7BS染色體上，可解釋3.7%～13.4%的表型變異；2017年，該作者利用90 K與660 K芯片，對(duì)10個(gè)環(huán)境中種植的256個(gè)小麥品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS),在1A (2)、2A (2)、2B、3A (2)、3B (4)、3D、4A、4B (2)、5A (3)、5B (3)、6A (2)、6B(2)、6D、7A (6)、7B (2)和7D (3) 共16條染色體上檢測(cè)到37個(gè)抗性位點(diǎn)，解釋7.9%～23.1%的表型變異[19,47]。Lü等[48]2020年以406個(gè)小麥品種為材料，結(jié)合90 K與660 K芯片的基因型數(shù)據(jù)與6個(gè)環(huán)境的自然黑胚率進(jìn)行GWAS，共檢測(cè)到76個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在小麥所有的染色體上，能解釋9.3%～34.9%的表型變異；同時(shí)，該作者以源于UC1110/PI610750的F10代RIL群體為材料，定位了3個(gè)抗黑胚病QTL,QBP.hau-3A、23QBP.hau-6D與QBP.hau-7D,分別解釋了6.8%、7.8%與8.8%的表型變異，結(jié)合GWAS與QTL定位結(jié)果，其認(rèn)為QBP.hau-6D是最重要的抗黑胚病新位點(diǎn)。LI等[21]2020年利用101份材料構(gòu)成的不完全雙列雜交群體的55K芯片基因型數(shù)據(jù)、結(jié)合3點(diǎn)2 a接菌鑒定的黑胚率，檢測(cè)到53個(gè)與小麥B.sorokiniana黑胚病顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，位于1B (3)、1D、2A (3)、2B (3)、2D (3)、3A (3)、3B(4)、3D (2)、4A,4B、4D (3)、5A (5)、5B (3)、5D (2)、6A(2)、6B (4)、6D、7A(4)、7B和7D(4) 共20條染色體上，可解釋8.6%～16.2%的表型變異。目前已報(bào)道的抗黑胚病位點(diǎn)已多達(dá)235個(gè)[17,19,21,23,39,43,44-48]。根據(jù)GWAS結(jié)果分析中常用的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)衰減距離分析報(bào)道的位點(diǎn)[19,21,45]，取普通小麥報(bào)道的較大的LD衰減距離為15 Mb[47]，物理位置超過(guò)LD衰減距離15 Mb的位點(diǎn)認(rèn)為是2個(gè)不同位點(diǎn)。已報(bào)道的194個(gè)抗黑胚病位點(diǎn)經(jīng)分析后為117個(gè)位點(diǎn)，分布在小麥所有的21條染色體上，第2、3、5同源群染色體上的抗性位點(diǎn)最多，分別有22、19與20個(gè)，第1同源群染色體上的最少，為12個(gè)，A、B、D基因組分別有36、45與36個(gè)位點(diǎn)(表1)。

125個(gè)位點(diǎn)中(表1)，在3個(gè)及以上研究中被同時(shí)檢測(cè)到的有24個(gè)，位于2A、2B(3)、2D、3A、3B(3)、4A、5A(2)、5B(3)、6A(2)、6B(2)、7A(2)、7B與7D(2)共13條染色體上，其中有7個(gè)位點(diǎn)在3個(gè)以上研究中的貢獻(xiàn)率大于10%，分別是2A(707.0～774.9 Mb)、3A(682.2～743.5 Mb)、3B (18.8～62.1 Mb)、3B (691.4～773.9 Mb)、6A (5.8～94.2 Mb)、7A (609.5～720.8 Mb)、7B (729.2～730.1 Mb)，特別是2A與6A上的位點(diǎn)在所有的5個(gè)及以上研究中均被檢測(cè)到[17,19,21,39,47-48]。這7個(gè)穩(wěn)定存在、貢獻(xiàn)率較大的位點(diǎn)可能在抗黑胚病遺傳中發(fā)揮著重要作用，但是其抗病效應(yīng)尚不明確。

表1 小麥抗黑胚病位點(diǎn)Table 1 Reported loci associated with resistance to black point in wheat

續(xù)表 Continuing table

續(xù)表 Continuing table

2.2 小麥抗黑胚病候選基因分析研究

將與黑胚病抗性顯著關(guān)聯(lián)SNP(single nudeotide polymorphism)標(biāo)記的探針(側(cè)翼)序列，在NCBI (the National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和ENA (European Nucleotide Arvhive,http://www.ebi.ac.uk/ena)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn和BLASTx，可以檢索與黑胚病抗性相關(guān)的候選基因[17,19,21]。

LIU等[17]將9個(gè)黑胚病抗性QTL連鎖標(biāo)記的探針序列在NCBI和ENA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，篩選到3個(gè)候選基因，即過(guò)氧化物酶生物合成蛋白 (peroxidase biosynthesizes protein)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體(serine/threonine-protein kinase receptor)與編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子SM153-1的MYB基因；該作者也對(duì)GWAS分析中與黑胚病抗性關(guān)聯(lián)SNP的探針序列進(jìn)行檢索，發(fā)掘到7個(gè)候選基因[19,47]。LI等[21]通過(guò)該方法篩選到3個(gè)黑胚病抗性候選基因。除上述3個(gè)基因外，還有多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、F-box蛋白(F-box proten)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)、鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(zinc finger protein)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、赤霉素生物合成(gibberellin biosynthetic process)、U-box結(jié)構(gòu)域蛋白(U-box domain-containing protein) 基因等。最近，LIU等[52]將3B染色體上的QTLQBp.caas3BL精細(xì)定位到1.7 Mb的物理區(qū)間，包含5個(gè)候選基因(TraesCS3B02G404300,TraesCS3B02G404400,TraesCS3B02G404500,TraesCS3B02G404600與TraesCS3B02G404700)，其中前4個(gè)是與ABI5(abscisic acid-insensitive 5)同源的bZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子，而TraesCS3B02G404700是蛋白磷酸酶(protein phosphatase)基因的同源物。

已報(bào)道的這些抗黑胚病候選基因按照功能基本上分為3類：1)與酚類化合物的氧化有關(guān)，主要包括過(guò)氧化物酶體生物合成蛋白、POD與PPO。在植物體內(nèi)，POD與PPO催化酚類底物形成醌類化合物，醌類轉(zhuǎn)化為黑色素等黑變物質(zhì)[53-55]。這是目前黑胚病癥狀形成的主要機(jī)制，即通過(guò)酶促褐變形成植物黑色素從而產(chǎn)生黑胚癥狀[56-57]，所以，這類候選基因與小麥黑胚病的癥狀形成相關(guān)。2)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，主要包括赤霉素(gibberellin,GA)生物合成、F-box、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體基因。GA參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)過(guò)程遭受脅迫后的抗逆應(yīng)答途徑，可能通過(guò)調(diào)控成熟前的穗發(fā)芽影響黑胚病的形成，而F-box蛋白可以調(diào)節(jié)GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[58-59]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶通過(guò)參與外界環(huán)境信號(hào)的感知和傳導(dǎo)，觸發(fā)應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫的多種生理生化反應(yīng)，在植物遭受外界脅迫后的應(yīng)答過(guò)程中起著重要作用，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體配合絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶完成信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[60-61]。由此類基因功能推測(cè)，小麥黑胚病抗性與GA介導(dǎo)的植物信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。3)與植物受到真菌侵染后的防御機(jī)制有關(guān)，如鋅指結(jié)構(gòu)蛋白、U-box結(jié)構(gòu)域蛋白、MYB轉(zhuǎn)錄因子等。鋅指結(jié)構(gòu)蛋白是逆境轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)，其被干擾或過(guò)量表達(dá)后，可顯著降低或增強(qiáng)植物的抗逆性[62-63]。U-box結(jié)構(gòu)域蛋白具有E3泛素連接酶活性[64]，在煙草和番茄中參與應(yīng)對(duì)真菌侵染的防御機(jī)制[65]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)一類多功能蛋白家族，在植物遭受如病菌侵染等生物脅迫和高溫、干旱等非生物脅迫后的應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮重要作用[66-67]。ABE等[68]認(rèn)為，該轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)節(jié)POD基因的表達(dá)，間接調(diào)控酚類化合物氧化還原速率，從而影響黑胚癥狀的形成。在籽粒發(fā)育過(guò)程中，由于病原菌侵染等生物脅迫或者干旱、高溫等非生物脅迫引起小麥籽粒內(nèi)部活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增加，抗病小麥種質(zhì)能夠通過(guò)抗氧化酶活性增強(qiáng)等途徑及時(shí)清除過(guò)量的ROS、而感病小麥種質(zhì)由于抗脅迫相關(guān)的蛋白含量較低[69]，不能及時(shí)清除過(guò)量的ROS，導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損使POD或PPO與底物接觸而引起酶促褐變[56,70]。小麥黑胚病抗性與脅迫應(yīng)對(duì)能力和酶促褐變過(guò)程相關(guān)，涉及諸多的生理生化機(jī)制。這些候選基因在小麥抗黑胚病中的作用還需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

3 小麥抗黑胚病遺傳研究的思考

3.1 分子標(biāo)記缺乏制約著黑胚病抗性育種的發(fā)展

普通小麥中國(guó)春測(cè)序計(jì)劃的完成(https://urgi.versailles.inra.fr/jbrowseiwgsc/gmod_jbrowse/?data=my Data%2FIWGSC_RefSeq_v1.0，IWGSC)，新一代測(cè)序技術(shù)和芯片技術(shù)的成熟，為小麥黑胚病抗性位點(diǎn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)技術(shù)，把抗病QTL/基因轉(zhuǎn)育到高產(chǎn)品種中以培育抗病新品種是控制小麥黑胚病的有效途徑[3,14,21,42]。黑胚病在小麥籽粒灌漿形成，其接菌鑒定在開(kāi)花后進(jìn)行[38]，鑒定結(jié)果在收獲脫粒后才能看到，不僅持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，程序復(fù)雜，而且當(dāng)年的鑒定結(jié)果只能指導(dǎo)下一年的雜交組合配置。在表型鑒定費(fèi)時(shí)、煩瑣、結(jié)果又不太穩(wěn)定的情況下，MAS在黑胚病抗性育種中更為重要，能夠減輕工作量、有效促進(jìn)抗病育種進(jìn)程。然而，自從20世紀(jì)30年代黑胚病被報(bào)道以來(lái)[41]，受多種因素的影響，尤其是受其表型鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力且結(jié)果不穩(wěn)定的制約，黑胚病的抗性位點(diǎn)研究相對(duì)緩慢，至今也沒(méi)有育種中可用的分子標(biāo)記的報(bào)道，這種現(xiàn)狀嚴(yán)重制約著小麥抗黑胚病育種進(jìn)程，急需實(shí)用的分子標(biāo)記用于MAS。

3.2 主效抗黑胚病位點(diǎn)不明確制約實(shí)用分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

小麥黑胚病抗性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，雖然已報(bào)道的抗病位點(diǎn)多達(dá)230多個(gè)，且多數(shù)位點(diǎn)具有顯著的加性效應(yīng)[17,19,21,46-47]，但是位點(diǎn)很分散，每條染色體上都有、每個(gè)位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率都不高，聚合6～8個(gè)抗性位點(diǎn)時(shí)，才能有較高水平的抗性(黑胚率<15%)[19]，這種現(xiàn)狀給抗黑胚病小麥新品種選育帶來(lái)不小的困難。所以，應(yīng)加強(qiáng)小麥抗黑胚病主效位點(diǎn)效應(yīng)分析。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，在黑胚病抗性位點(diǎn)研究中應(yīng)關(guān)注以下3個(gè)方面：

1)選準(zhǔn)親本、準(zhǔn)確鑒定表型。如前所述，因?yàn)槭苤虏【c環(huán)境的雙重影響，以自然發(fā)病率為依據(jù)篩選的抗病材料的真實(shí)性有待接菌鑒定的驗(yàn)證，若以此為試驗(yàn)材料進(jìn)行黑胚病抗性位點(diǎn)的定位研究得出的結(jié)果也未必可靠。所以，首先，應(yīng)該明確本地區(qū)小麥黑胚病的主要致病菌，然后通過(guò)接菌鑒定的方法篩選真正的抗病親本；其次，要采取可靠、可行的黑胚病抗性鑒定方法，如“孢子液噴灑、套袋保濕”的方法[71]對(duì)親本及遺傳群體進(jìn)行表型鑒定。最后以接菌鑒定的抗、感黑胚病小麥材料為親本，構(gòu)建遺傳分離群體并進(jìn)行接菌鑒定，以獲取準(zhǔn)確的表型數(shù)據(jù)，為抗性位點(diǎn)的定位奠定良好的基礎(chǔ)。

2)針對(duì)特定病原菌、定位主效QTL。小麥黑胚病致病菌復(fù)雜，由于存在寄主—病原互作，小麥對(duì)不同病原菌引起的黑胚病的抗性機(jī)制不一樣[20,25,36-37]，如果僅在自然條件下進(jìn)行黑胚率調(diào)查來(lái)進(jìn)行QTL定位，可能結(jié)果不可靠且得不到效應(yīng)較大的QTL。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥黑胚病抗性位點(diǎn)研究的最大不足可能正是不針對(duì)特定病原菌、不進(jìn)行接菌鑒定表型的條件下開(kāi)展籠統(tǒng)的定位研究[19,41,46-47]。小麥黑胚病的抗性研究應(yīng)該針對(duì)不同的病原菌、尤其是A.alternata、B.sorokiniana等優(yōu)勢(shì)病原菌開(kāi)展研究，以定位針對(duì)不同病原菌的主效QTL,并且構(gòu)建近等基因系等遺傳群體對(duì)主效QTL的抗病效應(yīng)進(jìn)行分析，然后在育種中通過(guò)MAS技術(shù)，將抗不同病原菌的主效QTL聚合在同一農(nóng)藝親本中，培育抗多種病原菌的品系，這樣的抗病品系才能在不同的地點(diǎn)不同年度間維持穩(wěn)定的抗病性。

3)結(jié)合不同方法優(yōu)勢(shì)、加快抗性遺傳研究進(jìn)程。復(fù)雜數(shù)量性狀QTL定位是植物遺傳學(xué)研究的難題，基于雙親群體的連鎖分析與基于自然群體的GWAS是目前抗性位點(diǎn)定位的2種主要方法，此外，集群分離分析法(bulked segregant analysis，BSA)也逐漸的應(yīng)用于小麥抗病位點(diǎn)的定位研究，BSR-Seq是BSA與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)結(jié)合的快速標(biāo)記開(kāi)發(fā)和基因定位的有效方法[72]。GWAS利用多樣的自然群體，遺傳變異豐富，可短時(shí)間內(nèi)發(fā)掘更多的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，且分辨率較高；然而，對(duì)于群體中稀有等位基因位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)效力，對(duì)微效位點(diǎn)的檢測(cè)效力有限。連鎖分析可以定位到微效QTL，也直接用于發(fā)展精細(xì)定位群體；然而，雙親分離群體構(gòu)建時(shí)間較長(zhǎng)，QTL受到雙親遺傳多樣性及是否分離的限制，一般初定位精度有限。BSA法不需要對(duì)每個(gè)單株/家系進(jìn)行基因分型，節(jié)約成本，可快速定位并檢測(cè)出緊密連鎖的標(biāo)記；但是，該方法的準(zhǔn)確性受群體遺傳背景、樣品數(shù)量、標(biāo)記類型、分析方法和表型鑒定準(zhǔn)確度等因素影響[46]。在小麥對(duì)黑胚病抗性位點(diǎn)的研究中，可以結(jié)合不同方法，更快、更準(zhǔn)確地定位穩(wěn)定遺傳的主效位點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)實(shí)用的分子標(biāo)記，以促進(jìn)抗黑胚病小麥育種進(jìn)程。