■金 松 黃振吾 胡晨輝 楊艷艷 呂增鵬

（1.常州市動物疫病預防控制中心，江蘇 常州 213000；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，江蘇 南京 210095；3.北京市飼料工業(yè)協(xié)會，北京 100107；4.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193）

隨著飼用抗生素在動物生產(chǎn)中的限制使用，越來越多的植物提取物被應用于家禽飼料中。植物提取物中大多含有苦味物質(zhì)，鳥類能夠很好地識別食物中富含的多酚類苦味有毒物質(zhì)[1-4]。雖然家禽的味覺在很大程度上演變?yōu)閷︼暳蠣I養(yǎng)的自然反應，但是家禽在被動的學習逃避試驗中能夠很好地識別鄰氨基苯甲酸甲酯（苦味劑）。因此，研究苦味物質(zhì)對肉仔雞骨骼肌發(fā)育和生長性能的影響，對于指導具有苦味的植物提取物添加劑在家禽飼料中的合理運用具有重要意義。苯甲地那銨（DB）是一種苦味激動劑，被廣泛用于苦味生理效應相關研究[5]。盡管雞只有三種苦味受體：ggTas2R1、ggTas2R2和ggTas2R7，但同樣表現(xiàn)出苦味敏感性[6]。前期研究表明，DB和大豆提取物——染料木黃酮均可以激活心臟、肝臟等器官的苦味受體表達[7]。并且，飼料中添加DB能夠損傷空腸上皮的形態(tài)，誘導苦味受體相關的細胞凋亡，對肉仔雞腸道的發(fā)育產(chǎn)生不利影響[8]。據(jù)此，推測DB可能也會對肉仔雞的骨骼肌發(fā)育和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生不利影響。本試驗在日糧中添加梯度濃度的DB，旨在闡明其對肉仔雞的骨骼肌發(fā)育的作用，研究對于富含苦味物質(zhì)的植物提取物在家禽飼料中的應用具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苯甲地那銨：純度為98%（阿達瑪斯試劑有限公司，南京）。

1.2 試驗動物及日糧

試驗動物選用1日齡黃羽肉雞，參照中國雞飼養(yǎng)標準（2004）配制0～4 周齡和5～8 周齡合成粉狀全價料，基礎日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

動物飼養(yǎng)試驗地點為南京農(nóng)業(yè)大學動物實驗基地，試驗流程嚴格按照南京農(nóng)業(yè)大學動物福利委員會相關規(guī)定進行。試驗選用體重相近的1日齡黃羽雄性肉仔雞240只，隨機分為4組：對照組（CON）；低劑量苯甲地那銨組（LDB）；中劑量苯甲地那銨組（MDB）；高劑量苯甲地那銨組（HDB），每組5個重復，每個重復12只雞。所有肉仔雞在負壓通風的雞舍中籠養(yǎng)，每籠12只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎日糧，LDB、MDB組和HDB組在基礎日糧中分別添加5、20 mg/kg和100 mg/kg DB。試驗周期為8周。肉仔雞在試驗期間自由飲水，飼養(yǎng)管理按快大型黃羽肉雞管理的常規(guī)程序進行。

1.4 樣品采集

試驗第8 周結(jié)束，所有雞稱量體重后，每個重復中隨機選擇2 只雞于翅靜脈處采集血液。收集的血液4 ℃靜置，12 h后在低溫離心機中以3 000 r/min離心10 min得到血清，隨后將血清樣品保存在-20 ℃直至分析。肉雞采集完血液后通過頸靜脈放血處死，立即分離右側(cè)胸肌組織后稱重，用于計算胸肌指數(shù)。于右側(cè)胸肌組織相同位置分別取大小相近的組織塊固定在4%多聚甲醛溶液中，待組織學分析。采集肉雞左側(cè)相同位置胸肌組織立即置于液氮中凍存，隨后保存于-80 ℃至樣品檢測。

胸肌指數(shù)（%）=右側(cè)胸肌重（g）/活體重（g）×100

1.5 血清生化指標測定

使用Spark 20 M酶標儀（Tecan公司，瑞士）和商用試劑盒（A113-1-1、A112-1-1、C010-2-1、C009-2-1、A028-2-1、C012-2-1、C011-2-1、A111-1-1 、A110-1-1、A045-2-2，南京建成生物工程研究所，南京）檢測低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）、總膽固醇(TCHO）、三酰甘油（TG）和總蛋白（TP）等血清生化指標。

1.6 胸肌組織學分析

4%多聚甲醛固定的胸肌組織經(jīng)修整后，用梯度濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，并進行石蠟包埋。用切片機（Leica Biosystems, Buffalo Grove, 美國）從每個石蠟塊中獲得5 μm的切片。用二甲苯除去石蠟，梯度乙醇復水后，蘇木精和伊紅（H.E.）染色。使用Velleman和Nestor 描述的方法測量組織切片的肌纖維寬度[9]。使用帶有Olympus Magna Fire數(shù)碼相機的Olympus XI 70顯微鏡拍攝，并使用Image-Proplus 6.0進行分析。

1.7 基因表達檢測

取凍存的100 mg 胸肌組織樣品加入1 mL Trizol（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，美國）提取液，嚴格按照試劑盒說明書提取總RNA。提取的總RNA用核酸分光光度計（AG 22331，Eppendorf，Hamburg，德國）檢測其純度和濃度，在260/280 nm 下測定值大于1.8認為RNA提取質(zhì)量較好。根據(jù)試劑盒說明書采用M-MLV cDNA試劑盒（Invitrogen Life Technologies）進行反轉(zhuǎn)錄反應。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按照1∶1 稀釋后備用。選用SYBR?Select Master Mix PCR Kit（R323-01，諾唯贊生物公司，南京）進行RT-PCR（Real-TimePolymerase Chain Reaction）檢測，反應儀器為7500熒光檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，美國）。目標基因和內(nèi)參基因GADPH的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列如表2所示。PCR反應程序如下：變性95 ℃30 s，循環(huán)次數(shù)40，熔解曲線：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。使用熔解曲線驗證引物的擴增效率后，針對內(nèi)參基因GADPH 標準化，并通過2-ΔΔCt方法分析相對基因表達水平。

表2 基因的引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS（version 25.0）軟件中的one-way ANOVA程序進行統(tǒng)計分析。組間差異顯著時，以Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.10 判定為具有差異的趨勢。試驗結(jié)果描述為“平均值±標準誤”。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能和胸肌指標（見表3）

如表3所示，試驗第8周末，相比于CON組，飼料中添加5、20 mg/kg 和100 mg/kg DB 顯著降低肉仔雞的體重和胸肌重（P＜0.05）。然而與CON組相比，飼料中添加DB對胸肌指數(shù)沒有顯著差異。

表3 DB對肉仔雞生長性能和胸肌指數(shù)的影響（n=10）

2.2 血清生化指標（見表4）

表4 DB對肉仔雞血清生化指標的影響

如表4所示，與CON組相比，隨著飼料中DB添加量的增加，肉雞血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）和尿酸（UA）水平逐漸升高后下降。MDB組和HDB組血清中尿酸水平均顯著高于CON組和LDB組（P＜0.05）。然而，隨著飼料中DB添加量的增加，肉雞血清中總蛋白（TP）逐漸降低后升高。飼料中添加5、20 mg/kg和100 mg/kg DB顯著降低肉仔雞血清中總蛋白水平（P＜0.05）。此外，與CON組相比，飼料中補充不同含量DB，并未顯著改變?nèi)怆u血清中其他生化指標。

2.3 胸肌組織學分析（見圖1）

如圖1A所示，飼料中添加DB可使肉仔雞胸肌纖維間隙增大，肌纖維寬度明顯降低。統(tǒng)計結(jié)果表明，LDB 組胸肌纖維直徑較對照組顯著降低，MDB 組和HDB 組胸肌纖維直徑較CON 組和LDB 組顯著降低（P＜0.05，圖1B）。然而DB對肉仔雞胸肌單位面積（胸肌纖維密度）沒有顯著影響（圖1C）。

圖1 DB對肉仔雞胸肌組織學形態(tài)的影響

2.4 胸肌苦味受體相關基因mRNA表達（見圖2）

如圖2所示，飼料中添加DB對胸肌苦味受體基因ggTas2R1、ggTas2R2的mRNA表達水平?jīng)]有顯著影響。LDB組和CON組胸肌ggTas2R7基因mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異，然而MDB 組和HDB 組ggTas2R7基因mRNA 表達水平較CON 組和LDB 組顯著提高（P＜0.05）。HDB組胸肌苦味受體下游PLCβ2基因mRNA表達水平較CON、LDB組和MDB組有顯著提高（P＜0.05）。同時，LDB、MDB組和HDB組處理相對于CON組顯著提高肉仔雞胸肌中IP3R3基因mRNA表達水平（P＜0.05）。

圖2 DB對肉仔雞胸肌苦味受體相關基因mRNA表達的影響

2.5 胸肌肌纖維發(fā)育和蛋白質(zhì)代謝相關基因mRNA表達（見圖3）

圖3 BD對肉仔雞胸肌肌纖維發(fā)育和蛋白代謝相關mRNA表達的影響

如圖3A 所示，與對照組相比，飼料中添加DB 對肉仔雞胸肌基因MSTN、Pax-7、MyoG和MyoD的mRNA 相對表達水平?jīng)]有顯著影響。如圖3B 所示，MDB 組和HDB 組相比于CON 組顯著提高胸肌中Atrogin-1 的mRNA 表達水平。HDB 組胸肌中MuRF1的mRNA 表達水平較CON 組和LDB 組顯著上升（P＜0.05）。與CON 組相比，所有DB 組對肉仔雞胸肌中INSR、m-TOR、AKT的mRNA表達沒有顯著影響。

3 討論

3.1 DB對肉仔雞生長性能的影響

酚類、黃酮類、萜類和硫苷類等功能性植物提取物具有苦味[10]。植物進化從自我保護角度合成苦味物質(zhì)，其目的是本身不被吃掉，因此這些味道對動物來說是難以接受[11]。大多研究往往關注這些功能性添加劑的有益生物學功能，但高劑量的苦味物質(zhì)能夠通過激活苦味受體對機體發(fā)育造成不利影響[12]。DB是化工合成的苦味劑，作為添加劑已被廣泛應用于飼料生產(chǎn)中。研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入低劑量DB 不會對大鼠或猴子表現(xiàn)出相關毒性[13]。本研究中使用安全劑量的DB作為苦味受體激動劑，探究其通過苦味受體信號通路對肉仔雞骨骼肌發(fā)育與代謝的調(diào)控作用，對于苦味性添加劑在家禽飼料中應用具有指導價值。Avau等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃內(nèi)給藥DB 能夠減輕肥胖小鼠的體重，這與飼糧中添加DB顯著降低了雄性肉仔雞的生長性能結(jié)果一致。Avau等[14]認為DB暴露導致體重減輕的可能原因是DB抑制平滑肌收縮，從而影響消化率和營養(yǎng)吸收。Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加DB會激活腸道苦味受體，并損傷仔雞腸道發(fā)育，可能是使仔雞生長性能降低的原因之一。骨骼肌是動物機體的重要組成部分，也是肉雞產(chǎn)生經(jīng)濟效益的主要部位[15]。仔雞肌纖維數(shù)量在胚胎期就已經(jīng)確定，孵化后肌肉發(fā)育主要依賴于蛋白沉積引起的肌纖維直徑增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加DB會顯著降低肉仔雞胸肌重和肌纖維直徑。推測DB可能通過影響蛋白質(zhì)代謝過程抑制肉仔雞骨骼肌發(fā)育，降低生長性能。

3.2 DB對肉仔雞血清生化指標的影響

血清生化成分的變化可以反映機體代謝和健康狀況[16]。在家禽中，尿酸（UA）是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，血清中UA 的水平可以作為反映體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的指標[17]。在本研究中，飼糧中添加DB 使肉仔雞血清中UA 濃度明顯上升，表明機體蛋白質(zhì)分解增強。血清白蛋白（ALB）和總蛋白（TP）是反映機體蛋白合成能力的兩個重要指標[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加DB 顯著降低了血清TP 水平，這表明DB 能夠減弱肉仔雞蛋白質(zhì)合成過程。以上結(jié)果表明，DB 可以通過抑制肉仔雞體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，促進蛋白質(zhì)分解，這與胸肌重量降低相一致。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是參與機體蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的兩種重要轉(zhuǎn)氨酶，其活性可以反映肝臟健康狀況。Dai等[19]研究表明家禽肝臟功能受損時血清AST 和ALT水平會顯著升高。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20 mg/kg和100 mg/kg的DB使血清中ALT含量較對照組顯著提高。這表明飼料中添加高劑量DB似乎會對肉仔雞肝臟代謝造成不利影響，但具體機制仍需要進一步研究。

3.3 DB對肉仔雞骨骼肌苦味受體基因表達的影響

苦味感知可以幫助動物從正常食物中分辨出潛在的有毒和有害物質(zhì)[20]。動物的苦味受體除了在味蕾中表達，還廣泛存在于體內(nèi)其他組織中[3-4]。Kok等[21]研究發(fā)現(xiàn)，激活肥胖小鼠的腸道苦味受體能夠調(diào)控激素分泌和膽汁酸代謝，從而減輕一些代謝疾病的相關癥狀。Hamdard等[7]研究表明，苦味受體基因的激活，能夠誘導肉仔雞心臟和腎臟的氧化損傷進程。以上研究表明，苦味受體在不同組織器官中可能存在不同生理功能。家禽中共有三種苦味受體，分別是gg-Tas2r1、ggTas2r2和ggTas2r7[22]。由于苦味受體數(shù)量較少，家禽是研究非味覺組織中苦味受體功能的一個適宜的模型[23]。本試驗中，飼糧中添加100 mg/kg的DB，顯著上調(diào)苦味受體基因ggTas2r7在肉仔雞骨骼肌中的表達水平。磷脂酶Cβ2（PLCβ2）和3 型肌醇-1，4，5-三磷酸受體（IP3R3）是苦味受體的下游基因，能夠參與肌肉代謝的過程[24]。與苦味受體變化一致的是，高劑量的DB 能顯著提升PLCβ2 和IP3R3在肌肉中的表達水平。以上結(jié)果表明，DB 能夠通過激活苦味受體，參與骨骼肌的代謝。在本試驗中，飼糧中添加5 mg/kg 和10 mg/kg DB 并未對骨骼肌中苦味受體及下游基因的表達產(chǎn)生顯著差異，但具有上升的趨勢。這表明DB對于肉仔雞苦味受體通路的激活可能具有劑量效應。相較于人類和嚙齒動物的8 000個味蕾，而雞只有200～300個[25]。同時，雞味蕾的大小似乎小于人類，表明雞的味覺靈敏度不如人類[8，26]。這也可能是低劑量DB對骨骼肌苦味受體通路基因表達水平未產(chǎn)生顯著差異的原因。

3.4 DB對肉仔雞肌肉發(fā)育和代謝相關基因表達的影響

肉仔雞骨骼肌肥大與機體的蛋白質(zhì)合成和分解代謝密切相關。當骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成速率高于分解速率，可促進肌纖維中粗、細肌絲的增加，使得骨骼肌肥大；反之，則導致骨骼肌萎縮[27]。雷帕霉素靶蛋白（m-TOR）信號通路和泛素-蛋白酶體通路途徑是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與分解的主要信號通路[28-29]。本研究中，檢測m-TOR 信號通路相關基因（INSR、m-TOR和AKT）的表達無顯著差異，表明DB對骨骼肌蛋白質(zhì)合成無顯著影響。萎縮素1（Atrogin-1）和肌肉環(huán)狀指基因1（MuRF-1）是編碼泛素-蛋白連接酶的基因，他們的表達是激活泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要原因之一[30-31]。在本試驗中，高劑量DB可以顯著增加肌肉中Atrogin-1 和MuRF-1 基因的表達。Glass 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白、肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白結(jié)合蛋白C等主要肌原纖維蛋白可以被MuRF-1分解。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加DB 可以使骨骼肌中蛋白質(zhì)的分解增強，與血清中尿酸水平升高的結(jié)果一致，這可能是導致肉仔雞體增重和骨骼肌重量降低的原因。Cheled-shoval 等[6]認為苦味受體下游基因IP3R3表達的上調(diào)將導致Ca2+從IP3敏感的Ca2+儲存中釋放，從而增加基礎胞質(zhì)Ca2+濃度。當基礎胞質(zhì)Ca2+濃度增加時，叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O 型（FOXO）去磷酸化增加[33]。FOXO 作為Atrogin-1 和MuRF-1 的轉(zhuǎn)錄因子，隨著FOXO去磷酸化增加，將上調(diào)其下游基因Atrogin-1和MuRF-1 的表達[34-35]。以上結(jié)果表明，飼糧中添加DB可能通過激活的苦味受體和泛素-蛋白酶體通路參與骨骼肌發(fā)育的調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

本試驗條件下，飼糧中添加DB 會降低肉雞的生產(chǎn)性能。其可能的機制是通過激活骨骼肌中苦味受體和泛素-蛋白酶體通路途徑促進蛋白質(zhì)水解進程，進而減少骨骼肌中蛋白質(zhì)沉積，抑制骨骼肌發(fā)育。本研究結(jié)果有助于更深入地揭示雞苦味受體在骨骼肌發(fā)育中的潛在調(diào)控機制，為苦味添加劑在雞飼料中的應用提供參考依據(jù)。