吳凡，金培印，王學惠

動脈粥樣硬化（AS）是冠狀動脈硬化性心臟病、腦梗死及外周血管病等心腦血管疾病發(fā)病的主要原因之一，已成為引起心腦血管疾病患者致死和致殘的重要原因[1]。目前，動脈粥樣硬化的發(fā)病機制還未被完全闡明，但研究指出高血壓、高血糖、吸煙遺傳等因素是動脈粥樣硬化發(fā)病的主要危險因素[2]，而內皮細胞損傷及其引起的級聯炎癥反應是引起動脈粥樣硬化病發(fā)生的重要步驟[3]。同型半胱氨酸（Hcy）是目前研究發(fā)現的通過損傷血管內皮細胞而促進動脈粥樣硬化斑塊形成的重要物質之一，其不僅被發(fā)現在冠狀動脈硬化性心臟病、腦卒中等心腦血管疾病患者的血液含量增高，還被認為是心腦血管疾病發(fā)病的危險因素[4,5]。之前的研究表明[6,7]，同型半胱氨酸在體外可以誘導血管內皮細胞凋亡，但其引起血管內皮細胞凋亡的分子機制還是清楚。

沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）是一種組蛋白去乙?；?，已經被證實參與調控哺乳動物細胞增殖、遷移和凋亡等等生物學功能[8]。Matteo等[9]研究發(fā)現，SIRT1通過抑制重建氧化還原平衡和恢復線粒體功能而抑制氧化應急引起的牛皮癬患者成纖維細胞的凋亡。此外，SIRT1還被發(fā)現可減輕缺氧引起的大鼠腦微血管內皮細胞損傷[10]和影響高糖環(huán)境下血管內皮細胞活力[11]。因此，本研究通過建立Hcy誘導血管內皮細胞體外損傷模型和過表達SIRT1內皮細胞系以研究Hcy處理對血管內皮細胞中SIRT1表達的影響，并探討上調血管內皮細胞中SIRT1表達對Hcy誘導的血管內皮細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與過表達SIRT1HMEC-1細胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清（10100-147，thermofisher，美國）的DMEM培養(yǎng)基（12491-15，thermo fisher，美國）中，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2。過表達SIRT1的慢病毒（pcDNASIRT1）購買自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司，并以空載質粒（pcDNA3.1）作為對照，慢病毒感染HMEC-1細胞72 h后，通過qPCR和免疫印記法檢測SIRT1表達以驗證過表達效率。

1.2 CCK8試劑盒和檢測細胞活性將0.2×105個HMEC-1細胞接種在96孔板的每個孔中，培養(yǎng)12 h后，向培養(yǎng)液中加入不同濃度的Hcy（0、1、2和4 mmol/L）處理24 h，去除細胞培養(yǎng)基后，將10 μl CCK8溶液（C0009，Beyotime Scientific，中國）和100 μl細胞培養(yǎng)基中加入到細胞中，在37℃和5%CO2下培養(yǎng)1 h后測定OD450。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡將1.0×106個HMEC-1細胞接種在6孔板的每個孔中，培養(yǎng)12 h后，然后向培養(yǎng)液中加入不同濃度的Hcy（0、1、2和4 mmol/L）處理24 h，收集HMEC-1細胞，根據Annexin V-FITC/PI（40302ES20，上海翊圣生物科技有限公司，中國）細胞凋亡檢測試劑盒所述檢測細胞凋亡情況。

1.4 實時熒光定量PCR細胞經不同方式處理后，被收集后通過加入適量的RNAiso以提取RNA。根據提取RNA的含量加入ddH2O溶解RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Scientific，USA）測定RNA濃度。然后用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉錄成cDNA。PCR參數設定：37℃/60 min，85℃/5 s。RT-qPCR：根據GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進行擴增。PCR引物如下：

SIRT1-F: 5'-TCGCAACTATACCCAGAACATA GACA-3'；

SIRT1-R: 5'-CTGTTGCAAAGGAACCATGACA-3'。β-actin引物參照之前的研究。

1.5 蛋白免疫印跡法細胞經不同方式處理后，被收集后通過RIPA裂解液（R0010，Solarbio，中國）從細胞中提取總蛋白。通過10%SDSPAGE分離50 μg總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用PBS洗滌膜3遍后，將膜與SIRT1抗體（ab189494，abcam，英國）在4℃孵育過夜。然后在室溫下添加二抗孵育2 h。用PBS洗滌3次后，加入ECL溶液（WBKLS0100，北京新晶科生物技術有限公司，中國）進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析方法所有數據均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hcy誘導血管內皮細胞凋亡將不同濃度的Hcy與血管內皮細胞培養(yǎng)24 h，通過CCK8試劑盒檢測細胞活性后發(fā)現，與0 mmol/L Hcy組相比，經1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內皮細胞活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且Hcy濃度越高，血管內皮細胞活性越低（如圖1A所示）；通過流式細胞儀分析不同組血管內皮細胞活性，與0 mmol/L Hcy組相比，經1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內皮細胞活性均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并且Hcy濃度越高，細胞凋亡率越高，具體如圖1B和1C所示。

圖1 同型半胱氨酸以劑量依賴形式誘導血管內皮細胞凋亡

2.2 Hcy抑制血管內皮細胞SIRT1的表達將不同濃度的Hcy與血管內皮細胞培養(yǎng)24 h，經qPCR檢測SIRT1 mRNA表達和經免疫印跡法檢測SIRT1蛋白表達，結果顯示：與0 mmol/L Hcy處理的血管內皮細胞相比，SIRT1在經1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內皮細胞中表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且Hcy濃度越高，SIRT1在血管內皮細胞中表達越低（圖2）。

圖2 同型半胱氨酸以劑量依賴形式抑制SIRT1在血管內皮細胞的表達

2.3 上調SIRT1減低Hcy誘導的血管內皮細胞的凋亡通過向血管內皮細胞中轉入pcDNA-SIRT1以上調SIRT1在血管內皮細胞中的表達，通過向血管內皮細胞中轉入空載質粒（pcDNA3.1）作為對照。經qPCR檢測SIRT1 mRNA表達和經免疫印跡法檢測SIRT1蛋白表達后發(fā)現，向血管內皮細胞中轉入pcDNA-SIRT1成功顯著上調血管內皮細胞中SIRT1的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A和圖3B。將表達SIRT1不同的血管內皮細胞與2 mmol/L同型半胱氨酸培養(yǎng)24 h，通過CCK8試劑盒測定血管內皮細胞活性，結果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNA-SIRT1組血管內皮細胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），如圖3C所示；并通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNA-SIRT1組血管內皮細胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見3D和3E。

圖3 過表達SIRT1抑制同型半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡

2.4 上調SIRT1對凋亡相關基因表達的影響將表達SIRT1不同的血管內皮細胞與2 mmol/L Hcy酸培養(yǎng)24 h，通過qPCR法檢測凋亡相關基因的表達，結果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNASIRT1組血管內皮細胞中Bcl2表達顯著降低，Bax和Cyt C表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4。

圖4 過表達SIRT1對同型半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡基因表達的影響

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中產生的重要中間產物。正常生理條件下，血液中的Hcy在體內被分解代謝，因此Hcy在體內維持在較低濃度。當機體病變時，Hcy因分解代謝受阻堆積使得濃度升高。研究表明高Hcy會大幅增加冠心病、外周血管疾病及腦血管疾病的發(fā)病風險，而其分子機制可能與Hcy引起血管內皮細胞損傷有關[6,7]。本研究發(fā)現，經Hcy處理的血管內皮細胞活性降低、凋亡增加，且Hcy濃度越高，血管內皮細胞活性越低，凋亡率越高，即以濃度依賴形式在體外誘導血管內皮細胞損傷。與宓寶斌等[12]研究結果一致，研究發(fā)現經0.5、1.0和1.5 mmol/L Hcy處理的ECV-304內皮細胞凋亡率逐漸升高，表明Hcy引起的血管內皮細胞凋亡與濃度有關。

此外，本研究還發(fā)現，Hcy以劑量依賴形式抑制血管內皮細胞中SIRT1的表達，與之前研究結果類似。Zhao等[13]研究發(fā)現，紅景天苷通過增加SIRT1蛋白的表達而氧化的低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷。Marampon等[14]研究表明，維生素D，一種在心腦血管疾病患者中常表現為缺乏的維生素，可通過上調SIRT1蛋白的表達而減輕輻射引起的內皮細胞衰老和凋亡。SIRT1是sirtuin蛋白家族的成員之一，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；?，其不僅通過去乙酰化組蛋白而維持染色質和基因組的穩(wěn)定，還可通過其去乙?；墙M蛋白的功能而參與細胞生物學功能的調控[8]，且之前研究發(fā)現SIRT1參與調控血管內皮細胞的凋亡。本研究結果提示，SIRT1參與調控內皮細胞的凋亡，且上調其表達可減輕外界因素誘導的內皮細胞凋亡。結合本次研究，Hcy可能通過下調SIRT1蛋白的表達而誘導血管內皮細胞的凋亡。

為了研究SIRT1表達對Hcy誘導的內皮細胞凋亡的影響，我們建立了過表達SIRT1內皮細胞系，結果發(fā)現：SIRT1過表達可以顯著降低Hcy誘導的血管內皮細胞凋亡。此外，我們研究還發(fā)現，SIRT1過表達可顯著抑制促凋亡基因Bcl2的表達和促進抗凋亡基因Bax、Cyt C的表達。根據起始caspase的不同，可將哺乳動物細胞的凋亡分為三種基本途徑[15,16]：一是外在途徑，即由細胞表面的死亡受體如fas和腫瘤壞死因子受體家族引發(fā)；另一種稱為內在途徑或線粒體途徑，由許多應激條件（如缺氧、低糖）、化學治療試劑和藥物所起始；第三種途徑是內質網應激導致caspase-12的活化，從而導致凋亡。此前研究已經證實，Hcy主要通過線粒體凋亡途徑引起的內皮細胞凋亡，即Hcy抑制內皮細胞Bcl-2的表達和促進內皮細胞Bax的表達而引起B(yǎng)ax/Bcl2比例失衡，引起細胞線粒體膜電位改變及線粒體細胞色素釋放，激活Caspase家族蛋白，最終導致內皮凋亡的發(fā)生[17]。因此，上調SIRT1是通過抑制線粒體凋亡途徑而抑制Hcy引起的內皮細胞凋亡。

綜上所述，Hcy可能通過抑制SIRT1的表達而誘導血管內皮細胞凋亡，而上調SIRT1表達可減少Hcy誘導的血管內皮細胞的凋亡，SIRT1是開發(fā)減少Hcy引起的血管內皮細胞損傷的潛在靶點。