阮迎春,彭森,孫鵬鵬,姜維娜,劉志晶,陳樺,

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,山東 青島 266071； 2 青島市市立醫(yī)院病理科； 3 青島市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)中心)

利用基因工程技術(shù)重編程成體細(xì)胞向特定譜系細(xì)胞分化是近年來再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)Octamer轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)即可觸發(fā)體細(xì)胞的重編程[1-3]。有研究將OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)入人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞(hHFMSC)后細(xì)胞由長梭形變?yōu)槎噙呅?，且逐漸出現(xiàn)一類小而圓的易懸浮細(xì)胞，其經(jīng)造血因子誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)分化為成熟紅細(xì)胞[4]；轉(zhuǎn)錄組測序分析基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，貼壁細(xì)胞中上調(diào)基因富集于胚胎發(fā)育，懸浮細(xì)胞中上調(diào)基因富集于造血譜系分化[5]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測OCT4對毛囊、表皮以及皮膚附屬器發(fā)育等組織特異性基因表達(dá)的調(diào)控作用，分析貼壁和懸浮細(xì)胞去分化程度的差異，探討OCT4對hHFMSC的去分化作用，以及去分化程度對細(xì)胞形態(tài)及黏附性的影響，為hHFMSC在再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

hHFMSC為前期工作中從人毛囊真皮乳頭和真皮鞘中分離并鑒定獲得，用攜帶OCT4的慢病毒載體pLV-EF1α-OCT4-IRES-EGFP及含pVSVG、gag-pol和rev的包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。然后再用包裝成慢病毒顆粒感染hHFMSC而獲得hHFMSCOCT4。經(jīng)傳代培養(yǎng)12 d后獲得貼壁生長細(xì)胞亞群hHFMSCOCT4-adherent，收集hHFMSCOCT4-adherent上層培養(yǎng)液，以800 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)液重懸獲得懸浮細(xì)胞亞群hHFMSCOCT4-floating。hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating加含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS、10 μg/L bFGF和100 kU/L青霉素/鏈霉素的H-DMEM/F12培養(yǎng)液，移入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用Trizol提取各細(xì)胞樣品總RNA，每組設(shè)3個重復(fù)樣本。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；以mRNA短片段為模板合成cDNA，經(jīng)過純化、末端修復(fù)以及加A尾等處理后進(jìn)行PCR擴增。用Agilent 2100 Bioanalyzer對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行質(zhì)檢，使用Illumina HiSeq X Ten測序儀進(jìn)行測序。采用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，并對整個質(zhì)控過程中的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計匯總，htseq-count軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，用cufflinks軟件計算蛋白編碼基因的表達(dá)量(FPKM值)。

1.3 差異基因(DEG)篩選及富集計算

DEG篩選條件為差異倍數(shù)(FC)>2或<-2，且P<0.05。利用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對兩兩細(xì)胞對比的DEG進(jìn)行GO功能富集分析，計算Enrichment score。Enrichment score=(m/n)/(M/N)。其中，N為所有基因中具有GO注釋的基因數(shù)目；n為DEG中具有GO注釋的基因數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定GO條目的基因數(shù)目；m為注釋為某特定GO條目的DEG數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用basemean值估算各個樣本基因表達(dá)量，計算FC；負(fù)二項分布檢驗對reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗；利用超幾何分布檢驗計算GO功能中顯著富集的差異蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表的P值，對P值進(jìn)行多重檢驗糾正后得到FDR。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEG的功能富集分析

與hHFMSC進(jìn)行比較，hHFMSCOCT4-adherent中上調(diào)基因共有2 401個，下調(diào)基因共有1 882個；而hHFMSCOCT4-floating中上調(diào)基因3 107個，下調(diào)基因有2 999個。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中篩選出1 940個DEG，其中上調(diào)基因有833個，下調(diào)基因有1 107個。表明hHFMSCOCT4-floating與hHFMSC的轉(zhuǎn)錄本差異更為顯著，且貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞是兩種相對獨立的亞群。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對DEG的生物功能進(jìn)行GO Level 2水平的富集分析，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)。結(jié)果顯示，與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-adherent中DEG顯著富集于生物黏附、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程以及發(fā)育過程等生物過程，并發(fā)現(xiàn)DEG主要分布在細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)部分及細(xì)胞膜等細(xì)胞成分，主要具有結(jié)合、通道調(diào)節(jié)因子活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性及受體活性等分子功能(圖1)；與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-floating中DEG富集的生物過程主要包括生物黏附、生物調(diào)節(jié)、多器官過程和單器官過程等，DEG主要分布在細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)部分、大分子復(fù)合物、細(xì)胞膜等細(xì)胞成分中，并具有結(jié)合、催化活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性及轉(zhuǎn)運活性等分子功能(圖1)。說明OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞黏附性、細(xì)胞連接組分、器官發(fā)育潛能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活性均發(fā)生改變，提示細(xì)胞骨架可能發(fā)生重塑，黏附生長的方式可能改變，組織特異性基因轉(zhuǎn)錄失活及多潛能性基因轉(zhuǎn)錄激活共同協(xié)調(diào)器官或組織發(fā)育潛能，從而實現(xiàn)去分化與重編程。

2.2 組織特異性基因的富集分析

本文GO分析OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)對hHFMSC中組織特異性基因表達(dá)調(diào)控情況，結(jié)果顯示，與hHFMSC相比較，hHFMSCOCT4-adherent中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有12個(圖2A)，包括間充質(zhì)干細(xì)胞分化、表皮細(xì)胞命運特異化、表皮發(fā)育、毛囊發(fā)育與成熟、皮脂腺發(fā)育等；hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有3個，包括毛囊形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育以及毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后hHFMSC中毛囊以及皮膚組織的特異性基因表達(dá)下調(diào)，OCT4可能通過抑制組織特異性基因的表達(dá)而促使hHFMSC去分化(圖2B)。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因顯著富集于損傷修復(fù)與表皮延伸的負(fù)調(diào)控、毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)以及體毛水平定向建立的生物過程(圖2C)。hHFMSCOCT4-floating的低黏附性、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的改變及緊密連接通路基因的下調(diào)可能與組織特異性基因下調(diào)有關(guān)，從而失去了hHFMSC原有的細(xì)胞形態(tài)及生長方式。

圖2 OCT4重編程的hHFMSC中組織特異性基因的富集分析

2.3 毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織特異性基因的表達(dá)情況

與hHFMSC進(jìn)行比較，hHFMSCOCT4-adherent中有14個特異性基因顯著下調(diào)，其中KRT15、KRT34與表皮發(fā)育及角化相關(guān)，GLI2參與表皮細(xì)胞分化與基底細(xì)胞癌發(fā)生，COL17A1與基底膜形成有關(guān)，F(xiàn)ZD3、ALX4等與毛囊發(fā)育有關(guān)，RBPJ則在毛囊成熟、皮脂腺發(fā)育、表皮細(xì)胞命運的特異化中發(fā)揮重要作用；下調(diào)最顯著的基因為KRT15、FZD3與COL17A1，下調(diào)倍數(shù)分別為-6.92、-4.60和-5.74(圖3A)；而hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)最顯著的特異性基因包括毛囊形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因FOXQ1、FGF7及毛囊發(fā)育相關(guān)基因ALX4，下調(diào)倍數(shù)分別為-9.61、-6.23和-5.43(圖3B)。提示過表達(dá)OCT4后，hHFMSC中部分組織特異性基因表達(dá)下降，可能在一定程度上消除了基因組定向分化的記憶，抑制了hHFMSC毛囊及皮膚的特異性分化發(fā)育潛能，實現(xiàn)了重編程；與hHFMSCOCT4-adherent相比較，hHFMSCOCT4-floating中體毛水平定向建立的相關(guān)基因FZD6和ASTN2、表皮延伸負(fù)調(diào)控的相關(guān)基因CLASP1以及毛囊發(fā)育的相關(guān)基因MYSM1顯著下調(diào)(圖3C)。3組細(xì)胞兩兩比較均顯示MYSM1基因表達(dá)顯著下調(diào)，MYSM1基因可能是OCT4對hHFMSC發(fā)揮去分化作用的潛在靶點。

藍(lán)色表示所有基因富集的GO Level 2條目，紅色表示差異表達(dá)基因富集的GO Level 2條目。橫軸為條目名稱，縱軸表示對應(yīng)條目的基因數(shù)量和其百分比。

3 討 論

OCT4作為一種具有強大重編程作用的多潛能轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于胚胎干細(xì)胞(ESC)細(xì)胞核內(nèi)，在維持ESC的多潛能性和自我更新中發(fā)揮核心作用[6-8]。OCT4不僅可以維持生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的“干性”，其異位表達(dá)還可提高骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的“干性”[9]。細(xì)胞去分化是指細(xì)胞從高度專能性分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變到細(xì)胞重新獲得多潛能性的過程；細(xì)胞的去分化、轉(zhuǎn)分化以及重編程對于新細(xì)胞或組織的再生有重要意義[10]。重編程研究發(fā)現(xiàn)，OCT4、SOX2、KLF4和cMyc(OSKM)可將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)，還可以將子宮內(nèi)膜息肉與宮頸息肉來源的間質(zhì)干細(xì)胞去分化成胚胎樣細(xì)胞[11]。

Inf：Infinity，無窮大；-Inf：負(fù)無窮大。

轉(zhuǎn)分化研究發(fā)現(xiàn)，OCT4可以促使類胚體中肝細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，還可在內(nèi)皮誘導(dǎo)體系中促使肝癌干細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[12]。

毛囊是可再生的器官并且可進(jìn)行自我更新[13]。hHFMSC為存在于毛發(fā)真皮乳頭和真皮鞘中的間充質(zhì)干細(xì)胞，其免疫原性低且來源廣泛，在體外經(jīng)誘導(dǎo)具有成骨、成軟骨、成脂肪、成神經(jīng)和成肌肉等多向分化潛能[14]。前期研究將OCT4單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)入hHFMSC，經(jīng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)從長梭形變成多邊形，并逐漸由貼壁生長變成低黏附生長；通過轉(zhuǎn)錄組測序顯示基因表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，且貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄本；二者多潛能性生物過程和多潛能性基因的表達(dá)亦不同，即貼壁細(xì)胞傾向于胚胎發(fā)育，而懸浮細(xì)胞獲得一定造血譜系分化潛能[6]。結(jié)合本文研究結(jié)果，OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后下調(diào)基因顯著富集于毛囊、表皮及皮膚附屬器發(fā)育等生物過程，說明轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4使hHFMSC丟失了一部分組織特異性分化發(fā)育專能，從而實現(xiàn)去分化；由于轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，推測OCT4對hHFMSC的去分化作用可能影響了細(xì)胞形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)，且去分化程度的差異可能導(dǎo)致了貼壁細(xì)胞和懸浮兩種細(xì)胞亞群的產(chǎn)生。還有研究結(jié)果證實，RhoA/ROCK通路可通過肌動蛋白細(xì)胞骨架聚合參與平滑肌的去分化[15]；microRNA-138可以通過抑制F-肌動蛋白聚合導(dǎo)致軟骨細(xì)胞去分化[16]；此外，黏著斑的組裝可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型改變并發(fā)生去分化，說明細(xì)胞骨架蛋白及黏附分子與細(xì)胞去分化之間關(guān)系密切[17]。

本文對DEG進(jìn)一步深入分析顯示，OCT4可能通過調(diào)控KRT15、KRT34、ALX4及RBPJ等基因的下調(diào)使hHFMSC去分化，特別是毛囊發(fā)育基因MYSM1在各組細(xì)胞表達(dá)均下調(diào)，推測其可能是OCT4抑制hHFMSC組織特異性分化的潛在靶點；而懸浮細(xì)胞的類圓形形態(tài)以及低黏附性則有可能與hHFMSC更高程度的去分化狀態(tài)相對應(yīng)，或許與此亞群細(xì)胞更易誘導(dǎo)成造血細(xì)胞有關(guān)。但去分化與細(xì)胞骨架重塑及黏附性改變之間的因果關(guān)系尚不明確，且OCT4如何調(diào)控組織特異性基因表達(dá)的具體分子途徑尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，過表達(dá)OCT4對hHFMSC轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了重編程，可能通過下調(diào)組織特異性基因的表達(dá)在一定程度上抑制了其向毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織分化的專能性，從而賦予hHFMSC向造血譜系等多胚層組織及器官的分化潛能，且去分化程度及向造血譜系轉(zhuǎn)分化潛能可能與不同細(xì)胞亞群對應(yīng)的組織特異性基因表達(dá)譜有關(guān)。本文結(jié)果可為hHFMSC在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用提供了理論依據(jù)。