姚魯清,崔寶龍,何曉燕,趙芳,周暢

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 青島 266003)

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1]，可以導(dǎo)致延髓、軀體部肌肉萎縮[2-3]。約90%的ALS病例是散發(fā)性的，只有10%的ALS病例為家族性的[4-5]。目前還沒有有效的治療方法可以阻止疾病進(jìn)展。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)目前僅批準(zhǔn)利魯唑和依達(dá)拉奉作為有效延緩病程的藥物[6]。有研究證實(shí)，家族性ALS中部分病人的發(fā)病與超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變有關(guān)[5,7]，還有一部分病人發(fā)病與TARDBP基因突變有關(guān)。目前認(rèn)為TARDBP基因的突變可以導(dǎo)致異常TDP-43蛋白聚集而致病[7-9]。最新研究表明，TDP-43是ALS的病理性標(biāo)志物。BRETTSCHNEIDER等[10-11]發(fā)現(xiàn)，異常聚集TDP-43在體內(nèi)沉積具有病理特征性，從而提出4階段分期，進(jìn)一步突出了TDP-43在疾病進(jìn)展中的作用。研究表明，百草枯(PQ)可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生異常聚集的TDP-43蛋白[12]。

自噬是一種細(xì)胞進(jìn)行自我吞噬的過程，更是清除細(xì)胞錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的關(guān)鍵機(jī)制。影響細(xì)胞自噬機(jī)制的主要是饑餓狀態(tài)[13]、細(xì)胞凋亡[14]和某些藥物[15]等。細(xì)胞自噬異常，可使異?；蝈e(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，從而導(dǎo)致細(xì)胞器損傷及神經(jīng)元功能障礙[16]。通過調(diào)節(jié)自噬可以減少神經(jīng)變性病中的異常蛋白質(zhì)聚集。天然小分子生物堿的調(diào)節(jié)自噬作用已經(jīng)被廣泛探究[15]?？轮Z辛堿B(Cory B)作為一種天然小分子生物堿在帕金森病模型中可激活自噬、減少α突觸核蛋白的表達(dá)[17]。但是，Cory B在ALS模型中的作用尚無明確的研究。故本研究用PQ處理細(xì)胞制備ALS模型，探討Cory B是否可以通過調(diào)節(jié)自噬而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，以期為治療ALS提供新方向和新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

所用Cory B購(gòu)于MCE公司；PQ購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)于American Type Culture Collection公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)于Corning公司；胎牛血清購(gòu)于BI公司；所有抗體均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；LC3B購(gòu)于Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取回細(xì)胞后先復(fù)蘇細(xì)胞，再以800 r/min離心5 min，棄去上清液。用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d按1∶6比例進(jìn)行傳代。根據(jù)細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Control組)、模型組(PQ組)和Cory B干預(yù)組(PQ+Cory B組)。Control組：用加入PBS緩沖液200 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；PQ組：用加入PBS緩沖液100 μL和1 mmol/L的PQ 100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；PQ+Cory B組：用加入設(shè)定濃度Cory B 100 μL的培養(yǎng)液預(yù)處理細(xì)胞12 h，再加入1 mmol/L的PQ 100 μL處理細(xì)胞12 h。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集各組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后接種于96孔板中。按1∶10的體積比加入CCK8試劑，37 ℃孵育1 h后，于酶標(biāo)儀上測(cè)560 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值―空白組OD值)×100%。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.5 細(xì)胞免疫熒光染色

實(shí)驗(yàn)分組處理24 h，鋪板細(xì)胞，待細(xì)胞種植6孔板貼于玻片后，用40 g/L多聚甲醛固定液固定細(xì)胞20 min，PBS浸洗。接著用5 g/L TritonX室溫通透20 min，PBS浸洗。加入山羊血清封閉30 min，去除血清封閉液，加入LC3B一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。用PBS洗凈一抗后，在避光條件下，加入熒光二抗稀釋液孵育1 h。用PBS洗凈二抗后，加入DAPI避光孵育5 min復(fù)染核，以PBS洗凈DAPI，用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，觀察并收集圖像。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組處理24 h，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液、PMFS和蛋白酶抑制劑配成的試劑提取蛋白。采用BCA法測(cè)定每組的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳條件：80 V、40 min，120 V、45 min。電泳完畢，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為295 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min。加入50 g/L脫脂奶粉置搖床上常溫封閉1.5 h。去除封閉液，用TBST洗滌3次，每次10 min。加入按1∶1 000比例稀釋的TDP-43(兔源)、GADPH(鼠源)、LC3B(兔源)一抗4 ℃過夜。去除一抗，使用TBST洗滌3次，每次10 min。加入按1∶5 000比例稀釋的二抗(羊抗鼠和羊抗兔)，置搖床上室溫孵育1.5 h。去除二抗，使用TBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL發(fā)光液顯影，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。以GADPH作為對(duì)照計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PQ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞TDP-43聚集的影響

根據(jù)先前的研究[18-20]，用1 mmol/L PQ處理SH-SY5Y細(xì)胞12 h，然后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，PQ組細(xì)胞TDP-43(35 000)蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.838±0.456，較Control組(0.600±0.012)的表達(dá)量明顯增多(n=3，t=8.729，P<0.001)。見圖1。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，PQ誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)TDP-43(35 000)的異常聚集，該結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致。見圖2。

圖1 TDP-43蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)

2.2 Cory B對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，Control組和PQ組的細(xì)胞存活率分別為1.070±0.043和0.351±0.041(n=3)，PQ組的細(xì)胞存活率明顯降低(t=20.930，P<0.001)。PQ+不同濃度Cory B組(Cory B濃度分別為10、15、20、25、30 μmol/L)細(xì)胞存活率分別為0.434±0.046、0.517±0.016、0.618±0.007、0.705±0.010、0.634±0.018(n=6)，Cory B在一定濃度范圍內(nèi)，以劑量依賴的方式提高了1 mmol/L PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率(F=179.800，P<0.001)，當(dāng)Cory B濃度為25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到峰值。提示Cory B具有神經(jīng)保護(hù)作用，當(dāng)Cory B濃度為25 μmol/L 時(shí)細(xì)胞存活率最高，因此使用25 μmol/L的Cory B進(jìn)行后續(xù)研究。

SH-SY5Y細(xì)胞免疫熒光染色，箭頭(↑)示異常TDP43聚集體。Scale bar為100 μm。

2.3 Cory B對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響

為了研究Cory B是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，采用LC3B抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。熒光顯微鏡下觀察到，Control組細(xì)胞LC3B綠色點(diǎn)狀熒光在胞質(zhì)內(nèi)分布較彌散、不清，聚集分布不明顯；PQ組細(xì)胞LC3B在胞質(zhì)內(nèi)分布與Control組相似；與PQ組和Control組細(xì)胞相比較，PQ+Cory B組細(xì)胞內(nèi)呈綠色點(diǎn)狀熒光的LC3B明顯增多。見圖3。Control組、PQ組和PQ+Cory B組的免疫熒光定量分別為0.105±0.002、0.161±0.002和0.089±0.004(n=3)，3組比較差異有顯著性(F=10.809，P<0.001)。表明Cory B可激活PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

LC3是自噬標(biāo)志蛋白，一般分為分子量16 000的LC3-Ⅰ和分子量14 000的LC3-Ⅱ。自噬進(jìn)行時(shí)，LC3-Ⅰ會(huì)向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cory B的自噬誘導(dǎo)作用，采用Western blot方法檢測(cè)LC的表達(dá)水平，并計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。檢測(cè)結(jié)果顯示，Control組、PQ組、25.0 μmol/L Cory B組、PQ+12.5 μmol/L Cory B組和PQ+25.0 μmol/L Cory B組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別為2.099±0.165、0.785±0.049、4.212±0.355、1.754±0.116和5.099±0.472(n=5)。與PQ組和Control組相比，PQ+25.0 μmol/L Cory B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高(F=172.913，P<0.001)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Cory B可以促進(jìn)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬。見圖4。

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

2.4 Cory B對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞TDP-43蛋白表達(dá)的影響

為了研究Cory B是否可以減少TDP-43蛋白異常聚集，采用Western blot檢測(cè)TDP-43(35 000)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，Control組、PQ組和PQ+Cory B組TDP-43(35 000)蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.570±0.330、0.953±0.336、0.449±0.223(n=3)。與Control組相比，PQ組的TDP-43(35 000)蛋白表達(dá)明顯增高，而PQ+Cory B組的蛋白表達(dá)較PQ組明顯下降(F=229.791，P<0.001)。表明Cory B可以減少PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞異常的TDP-43蛋白聚集。見圖5。

圖5 SH-SY5Y細(xì)胞TDP-43蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

3 討 論

本研究根據(jù)先前的研究通過PQ的氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生異常聚集的TDP-43蛋白[12]，制備病理性TDP-43聚集的ALS細(xì)胞模型。不僅觀察到Cory B提高了PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，還觀察到Cory B可以激活自噬進(jìn)程，減少異常聚集TDP-43(35 000)蛋白的表達(dá)。

LC3B蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈點(diǎn)狀聚集，箭頭(↑)示自噬體生成。Scale bar為100 μm。

許多研究認(rèn)為，帕金森病、阿爾茨海默病、ALS及亨廷頓病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病與自噬途徑受損導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的異常聚集有關(guān)[22]。目前，關(guān)于通過調(diào)節(jié)自噬進(jìn)程治療神經(jīng)變性疾病的研究很多，RAVIKUMAR等[23]在亨廷頓病的細(xì)胞模型中進(jìn)行誘導(dǎo)自噬從而治療疾病的研究；ROSCIC等[24]的研究報(bào)道了誘導(dǎo)自噬可以減少亨廷頓病模型中蛋白質(zhì)異常聚集；STEELE等[25]也發(fā)現(xiàn)一些藥物可以通過誘導(dǎo)自噬減少阿爾茨海默病模型中Aβ蛋白的異常聚集[26]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，p-香豆酸(巴西綠色蜂膠中的活性成分)通過自噬作用在Neuro2a細(xì)胞中對(duì)致病性SOD1引起的神經(jīng)毒性起保護(hù)作用[27]。因此，激活自噬可能是清除神經(jīng)變性疾病病理性蛋白質(zhì)聚集的重要途徑。

Cory B是鉤藤中重要活性物質(zhì)，為吲哚生物堿中的一種。鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿及Cory B互為同分異構(gòu)體。鉤藤對(duì)心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)均存在廣泛的保護(hù)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面其應(yīng)用廣泛，在心血管系統(tǒng)疾病治療方面，其用于治療高血壓、心律失常也并不罕見。Cory B作為一種天然小分子生物堿，具有許多同分異構(gòu)體，CHEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Cory B的一種同分異構(gòu)體柯諾辛堿，也可以通過Akt/mTOR通路誘導(dǎo)自噬。本文研究結(jié)果表明，Cory B能夠減少PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞TDP-43蛋白的異常聚集，提高暴露于PQ的細(xì)胞的存活率，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在自噬方面，本研究結(jié)果顯示，Cory B可以促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，并減少分子量35 000的TDP-43蛋白的異常聚集，表明Cory B可能通過促進(jìn)自噬，分解異常聚集的蛋白質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但Cory B的具體作用機(jī)制目前仍不清楚。以往的研究證明[17]，Cory B主要通過Beclin-1依賴性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。自噬具有細(xì)胞保護(hù)作用，但這并不意味著我們可以無限制地激活自噬，過度激活自噬可以導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮，同時(shí)也能引起細(xì)胞死亡[29-30]。對(duì)自噬進(jìn)行更好的調(diào)控，可以使其達(dá)到治療疾病的目的[31]。鉤藤堿各種成分的作用，至今仍不完全清楚，但其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。本文的研究結(jié)果表明，對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控，可以減少異常的蛋白質(zhì)聚集，這進(jìn)一步揭示了神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制。這類天然小分子生物堿的自噬激活作用，雖然在抗腫瘤、抗衰老以及抗感染等方面有著重要作用，但在神經(jīng)變性疾病治療方面仍需要不斷探索。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究并沒有進(jìn)一步探究Cory B的自噬通路途徑。但本研究結(jié)果為今后探討Cory B的自噬激活作用與ALS之間的關(guān)系提供了參考方向，為治療ALS提供了新思路。