田靜,張學(xué)輝,車奎,遲靜薇,王顏剛

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科,山東 青島 266003； 2 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬成武醫(yī)院內(nèi)分泌科；3 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬成武醫(yī)院心血管內(nèi)科； 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心)

隨著生活水平的提高，2型糖尿病(T2DM)的患病率逐年增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示，T2DM病人非乙醇性脂肪肝(NAFL)的發(fā)生率高達(dá)49%～62%[1]。與單純T2DM病人比較，合并NAFL的T2DM病人的血糖水平更高、波動更大、更難控制，心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也增加。NAFL可能進(jìn)一步進(jìn)展為肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。異葒草素(ISO)是一種木犀草素糖苷類黃酮化合物，其分子式為C21H20O11，分子量為448.38，微溶于甲醇溶劑。ISO廣泛存在于竹茹、竹葉、西番蓮、集花龍膽、葫蘆果、滿天星、決明子、黃荊、蕎麥芽等多種植物的食用或藥用部位[4-11]。研究表明，ISO具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[12-14]。此外，ISO還具有保肝、降糖及調(diào)脂作用[6,15-16]。但I(xiàn)SO的具體作用機(jī)制目前尚未有深入研究。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼養(yǎng)及腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)方法構(gòu)建T2DM合并NAFL小鼠模型，研究ISO的保肝作用并探討其作用機(jī)制，以期為T2DM合并NAFL的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級4～5周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(25±3)g，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(京)2016-0006)。ISO(純度>98%)，購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；STZ購自美國MedChemExpress公司；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸(FFA)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)比色法試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf-2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(GLUT2)和β-actin抗體及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；顯影液購自美國MILLIPORE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物模型建立與藥物干預(yù) SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取12只作為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)；其余48只小鼠使用60%的高脂飼料喂養(yǎng)4周，然后連續(xù)5次腹腔注射小劑量(30 mg/kg)STZ，1周后檢測隨機(jī)血糖連續(xù)2次大于16.7 mmol/L診斷為T2DM小鼠。再繼續(xù)用60%的高脂飼料喂養(yǎng)4周，構(gòu)建T2DM合并NAFL模型。將造模成功的T2DM合并NAFL小鼠隨機(jī)分為模型對照組和ISO低、中、高劑量組，每組12只。ISO低、中、高劑量組分別按10、20、40 mg/kg劑量腹腔注射給藥；正常對照組和模型對照組給予等量的5 g/L羧甲基纖維素鈉腹腔注射。建模成功當(dāng)天記作第0天，每周檢測空腹血糖(FBG)水平，給藥8周后處死小鼠，留取血及肝組織標(biāo)本待檢。

1.2.2油紅O染色觀察肝組織脂肪樣變性 處死小鼠后立即取出部分肝臟組織，用OCT包埋劑包埋后冷凍切片，將冷凍切片復(fù)溫干燥，置固定液中固定，自來水沖洗。入油紅染液中浸染8～10 min，取出切片背景分化后浸入蘇木精中復(fù)染3～5 min，純水浸洗，分化液分化，蒸餾水沖洗，返藍(lán)液返藍(lán)，自來水浸洗，甘油明膠封片。光鏡下采集圖像并觀察各組肝組織細(xì)胞脂滴沉積情況。

1.2.3血清FBG檢測 末次干預(yù)后小鼠禁食12 h眼球采血收集血樣，離心收集血清并進(jìn)行分裝，配制工作試劑，在全自動生化分析儀上設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，上樣，全自動生化分析儀自動測定FBG值。

1.2.4肝組織脂質(zhì)和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 新鮮肝臟組織用超聲勻漿，取上清，采用BCA法檢測蛋白濃度。按照比色試劑盒操作步驟檢測TC、TG、FFA的含量以評估肝組織脂質(zhì)水平，檢測T-AOC、SOD、CAT、GSH、MDA水平以評估細(xì)胞內(nèi)抗氧化狀態(tài)。

1.2.5Western blotting檢測肝組織中Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白的表達(dá) 用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解肝組織，提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。按每泳道50 μg蛋白量上樣到SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓電泳10～15 min，120 V恒壓電泳約1 h；將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L的牛奶封閉液封閉2.5 h；分別加入一抗(Nrf-2、HO-1、GLUT2的稀釋比均為1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過夜，以TBST洗膜3次，每次10 min；分別加入二抗(稀釋比1∶2 000)室溫下脫色搖床孵育1.5 h，以TBST洗膜3次，每次10 min；應(yīng)用顯影液在生物分子成像儀(LAS 500，美國GE公司)中進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況及肝組織病理學(xué)改變

一般狀況：正常對照組小鼠活動狀態(tài)良好、行為敏捷，飲水及進(jìn)食正常，皮毛光滑整潔；模型對照組小鼠活動明顯減少，飲水及進(jìn)食明顯增加，尿量明顯增多，脫毛；ISO低、中、高劑量組小鼠的一般狀況與模型對照組相比有不同程度改善，以中、高劑量組改善比較明顯。

油紅O染色結(jié)果：正常對照組小鼠肝組織未見脂滴沉積；模型對照組小鼠肝組織可見彌漫性紅色脂滴形成，數(shù)量頗多；ISO低、中、高劑量組小鼠脂滴沉積較模型對照組逐漸減少，以中、高劑量組減少較顯著。見圖1。

2.2 小鼠血糖及肝組織脂質(zhì)水平變化

模型對照組小鼠的血清FBG水平以及肝組織TG、TC、FFA含量較正常對照組顯著增加，ISO低、中、高劑量組小鼠血清FBG水平以及肝組織TG、TC、FFA含量較模型對照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.612～1 183.454，P<0.001)。且ISO作用呈劑量依賴性。見表1。

2.3 小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平變化

與正常對照組相比，模型對照組小鼠肝組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH等抗氧化指標(biāo)水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著升高；與模型對照組相比，ISO低、中、高劑量組小鼠肝組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH水平顯著升高，MDA水平則顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.356～1 869.515，P<0.001)。且ISO作用具有明顯的劑量依賴性。見表2。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：ISO低劑量組；D：ISO中劑量組；E：ISO高劑量組。油紅O染色，400倍。

表1 各組小鼠血清FBG及肝組織脂質(zhì)水平的比較

表2 各組小鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 小鼠肝組織Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白表達(dá)水平變化

與正常對照組相比，模型對照組小鼠肝組織中Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與模型對照組相比，ISO低、中、高劑量組小鼠肝組織中Nrf-2、HO-1及GLUT2蛋白的表達(dá)水平顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.560～42.410，P<0.01)。ISO對Nrf-2及GLUT2蛋白表達(dá)水平的增高作用呈明顯的劑量依賴性，但對HO-1蛋白表達(dá)的增高作用無劑量依賴性。見圖2、表3。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：ISO低劑量組；D：ISO中劑量組；E：ISO高劑量組。

表3 各組小鼠肝組織Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

T2DM病人NAFL的發(fā)病率逐年增高[1]，而且T2DM和NAFL高度相關(guān)，互為因果，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)一步加重，嚴(yán)重威脅生命健康[17]。T2DM合并NAFL的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前學(xué)術(shù)界廣泛接受的學(xué)說是“二次打擊”學(xué)說：首次打擊是以胰島素抵抗為主要原因?qū)е碌闹|(zhì)在肝細(xì)胞胞質(zhì)中的沉積；再次打擊為氧化應(yīng)激反應(yīng)，指在首次打擊的基礎(chǔ)上，由活性氧(ROS)誘導(dǎo)發(fā)生在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一系列炎癥反應(yīng)[18-19]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)會進(jìn)一步加重胰島素抵抗，從而促進(jìn)T2DM合并NAFL的疾病進(jìn)展[20-21]。因此，改善胰島素抵抗、抗氧化是延緩T2DM合并NAFL疾病進(jìn)展的重要措施。

ISO是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、保肝、降糖及調(diào)脂作用[12-16]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂高糖飲食及腹腔注射STZ建立T2DM合并NAFL模型，同時(shí)應(yīng)用ISO處理成模小鼠。結(jié)果顯示，ISO處理的成模小鼠肝組織TG、TC、FFA及血清FBG水平均顯著下降，肝組織脂滴沉積明顯減少甚至消失，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA(可以間接反映體內(nèi)氧自由基的水平)水平明顯降低，而肝組織抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平顯著增高。表明ISO能改善T2DM合并NAFL模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，降低其FBG，抑制肝臟的氧化應(yīng)激。

研究表明，NAFL是由于慢性脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的肝臟脂毒性炎癥病變，其主要介導(dǎo)機(jī)制是胰島素抵抗和氧化應(yīng)激[18-19]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)其抗氧化系統(tǒng)被激活，Nrf-2是抗氧化體系中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子[22]。Nrf-2在肝臟中高表達(dá)，生理狀態(tài)下，Nrf-2存在于肝細(xì)胞胞漿中與其分子伴侶Keap1結(jié)合處于無活性狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf-2和Keap1解離，Nrf-2發(fā)生核轉(zhuǎn)位與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)上的GCTGAGTCA位點(diǎn)相結(jié)合，啟動抗氧化酶基因表達(dá)(包括HO-1、SOD及CAT等)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。前期研究表明，Nrf-2基因缺失可加重氧化應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞毒性[24]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯φ战M氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平較正常對照組明顯增高，抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平明顯降低，說明氧化體系與抗氧化體系失衡，存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而經(jīng)ISO處理的模型小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平較模型對照組明顯降低，抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平明顯增高，說明ISO小鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯減輕。同時(shí)，模型對照組小鼠肝組織抗氧化應(yīng)激信號通路Nrf-2/HO-1中的相關(guān)蛋白Nrf-2、HO-1表達(dá)量較正常對照組明顯降低，而經(jīng)ISO處理的模型小鼠肝組織Nrf-2、HO-1蛋白的表達(dá)量較模型對照組明顯增高，說明ISO通過激活Nrf-2/HO-1信號通路而起到抗氧化作用，從而減輕T2DM合并NAFL發(fā)病機(jī)制中的“第二次打擊”。有研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制[25-27]，因此ISO也間接減輕了T2DM合并NAFL發(fā)病機(jī)制中的“第一次打擊”。

有研究表明，高脂高糖飲食除了可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及ROS之外，還可導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)通路異常，誘發(fā)胰島素抵抗[28-29]。另有研究表明，抗氧化劑可干預(yù)這一過程，改善胰島素抵抗[30-32]。GLUT2是肝臟重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)機(jī)體處于高糖刺激時(shí)可促進(jìn)葡萄糖自血漿進(jìn)入胞質(zhì)[33-35]。T2DM時(shí)肝臟葡萄糖代謝紊亂可致肝臟GLUT2水平降低，說明糖尿病大鼠肝糖原含量減少與GLUT2表達(dá)下調(diào)有關(guān)[36-37]。PI3K/Akt信號通路是經(jīng)典的胰島素信號通路，此通路激活后可促進(jìn)肝臟GLUT2的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加肝糖原合成，抑制肝糖原分解，降低血糖濃度，減輕T2DM病人胰島素抵抗[36,38]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯φ战M小鼠肝組織中GLUT2蛋白的表達(dá)量顯著低于正常對照組，而經(jīng)ISO處理后模型小鼠肝組織中GLUT2蛋白的表達(dá)量顯著提高。GLUT2蛋白表達(dá)量提高可以促進(jìn)肝細(xì)胞對葡萄糖攝取，增加肝糖原合成，進(jìn)一步緩解T2DM合并NAFL小鼠肝臟胰島素抵抗，從而降低血糖水平以及減少以胰島素抵抗為中心的肝臟脂質(zhì)沉積，改善NAFL病情。

綜上所述，ISO能夠減輕T2DM合并NAFL小鼠肝臟的氧化應(yīng)激、胰島素抵抗及降低血糖，從而延緩T2DM合并NAFLD進(jìn)展、減輕病情。其機(jī)制與激活Nrf-2/HO-1信號通路，增加肝臟GLUT2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為ISO作為一種治療T2DM合并NAFL的新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但I(xiàn)SO改善T2DM合并NAFL小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深究。