王海燕，王釗華，馬 波

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，現已成為全球第四大女性癌癥。隨著宮頸癌篩查計劃的開展及HPV疫苗的推廣，部分早期宮頸癌及癌前病變患者得到及時治療，發(fā)病率和病死率都顯著降低。對于晚期及復發(fā)宮頸癌患者，化療是最常用的治療手段。順鉑是最有效的化療藥物之一，以其高效、低毒性的特征，在宮頸癌治療中發(fā)揮重要作用，但其耐藥性會降低化療效果，是晚期及復發(fā)宮頸癌患者預后不良的主要原因。青藤堿是從傳統(tǒng)中藥青風藤中提取的生物堿，常用于治療風濕性關節(jié)炎及神經疼痛，發(fā)揮其鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，且近期研究發(fā)現其具有一定抗癌活性。有報道顯示，青藤堿可通過抑制卵巢癌細胞活力，誘發(fā)細胞凋亡并誘導細胞周期停滯，發(fā)揮其抗腫瘤效應。然而，目前關于其對于宮頸癌細胞化療耐藥的作用及相關可能機制鮮有報道。本研究通過建立Hela細胞順鉑耐藥模型，研究青藤堿對順鉑耐藥性的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人卵巢癌Hela細胞系，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 青藤堿(純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司)，Notch通路特異性激活劑Jagged1蛋白(美國MCE公司)，順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H20040813，規(guī)格：30 mg)，MTT試劑盒(上海聯碩生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取試劑盒(上海研生實業(yè)有限公司)，兔抗人神經源性基因Notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1)、信號轉導及轉錄激活子3(signal transducer and ac- tivator of transcription 3，STAT3)、發(fā)狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split 1，Hes1)蛋白一抗(美國R&D公司)。

Synergy H4全功能酶標儀(美國Bio Tek公司)，Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)，PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR一體式凝膠成像分析儀(美國Bio-rad公司)

1.3 細胞培養(yǎng) 將人卵巢癌Hela細胞置于DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素雙抗)中，標準條件(37 ℃，5% CO)培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數生長期細胞作為實驗對象。

1.4 建立Hela細胞順鉑耐藥模型 取對數期Hela細胞加入完全培養(yǎng)液，分別加入不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 μg/ml)順鉑溶液，1周后耐藥性誘導完成。

1.5 MTT法檢測不同濃度順鉑對Hela、Hela/順鉑細胞的增殖抑制率 取對數期Hela、Hela/順鉑細胞，加入含順鉑(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培養(yǎng)液，干預48 h后每孔加20 μl MTT溶液(5.00 g/L)，2 h后棄上清，每孔加150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm吸光度值，計算細胞增殖抑制率(%)=(1-不同濃度順鉑 A值/空白對照A值)×100%，并計算半數抑制濃度(IC)。

1.6 細胞分組、干預取對數期Hela/順鉑細胞，PBS洗滌，調整細胞密度為1×10個/ml，接種于6孔板，待細胞融合至60%，采用簡單隨機分組的方式分為對照組、青藤堿組、激活劑組、青藤堿聯合激活劑組。對照組不處理，青藤堿組加入青藤堿DMSO溶液(40 μmol/L終濃度)，激活劑組加入Jagged1蛋白DMSO溶液(500 ng/ml)，青藤堿聯合激活劑組加入青藤堿DMSO溶液(40 μmol/L終濃度)+Jagged1蛋白生理鹽水溶液(500 ng/ml)。每組設置5個復孔，干預48 h后繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.7 MTT法檢測不同濃度順鉑對各組細胞的增殖抑制率 取各組細胞，加入含順鉑(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培養(yǎng)液，同1.5操作，計算細胞增殖抑制率(%)=(1-不同濃度順鉑 A值/空白對照A值)×100%，并計算半數抑制濃度(IC)。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組細胞，調整密度至1×10個/ml，接種于6孔板。更換為含8 μg/ml順鉑的DMEM培養(yǎng)液，干預48 h后PBS充分洗滌，2800 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)，預冷binding buffer標記液重懸細胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混合均勻，4 ℃遮光孵育15 min，加入5 μl PI染液染色5 min，過濾，60 min內經流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，CellQuest軟件分析數據。

1.9 Western blot法檢測細胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達 取各組細胞，加入預冷的RIPA裂解液裂解，注入離心管中，3500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，收集沉淀物，采用BCA法定量蛋白。取50 μg待測蛋白，與SDS-PAGE上樣緩沖液按1∶5的體積比均勻混合，100 ℃金屬浴加熱5 min，注入離心管中，8000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取其上清液，恒壓下行上樣電泳分離，30 min后經濕轉法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗人Notch1、Stat3、Hes1一抗(1:500)，4 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，采用一體式凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析結果，以Notch1、Stat3、Hes1蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量。

2 結 果

2.1 不同濃度順鉑對Hela、Hela/順鉑細胞的增殖抑制率、IC值 不同順鉑濃度對Hela、Hela/順鉑細胞增殖抑制率、IC值細胞間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)；不同順鉑濃度對Hela/順鉑細胞的增殖抑制率高于Hela細胞，IC值低于Hela細胞(<0.05，表1)。

表1 不同順鉑濃度對Hela、Hela/順鉑細胞增殖抑制率及IC50值比較

2.2 不同濃度順鉑對各組細胞的增殖抑制率、IC值 與對照組比較，青藤堿組不同順鉑濃度對細胞增殖抑制率升高，IC降低，激活劑組不同順鉑濃度對細胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯合激活組不同順鉑濃度對細胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；與激活劑組比較，青藤堿聯合激活組不同順鉑濃度對細胞增殖抑制率升高，IC降低(<0.05，表2)。

表2 不同順鉑濃度對各組細胞增殖抑制率及IC50值比較

2.3 凋亡率 對照組、青藤堿組、激活劑組、青藤堿聯合激活組凋亡率分別為(11.59±1.33)%、(24.68±3.96)%、(3.57±0.45)%、(16.12±3.01)%，與對照組比較，青藤堿組凋亡率升高(<0.05)，激活劑組凋亡率降低(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯合激活組凋亡率降低(<0.05)；與激活劑組比較，青藤堿聯合激活組凋亡率升高(<0.05，圖1)。

圖1 各組Hela細胞凋亡流式圖

2.4 細胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達 與對照組比較，青藤堿組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量降低(<0.05)，激活劑組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量升高(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯合激活劑組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量升高(<0.05)；與激活劑組比較，ATL聯合轉染組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量降低(<0.05，表3，圖2)。

表3 各組細胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量比較

圖2 Western Blot法檢測各組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量

3 討 論

宮頸癌是發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，多產生于子宮頸黏膜上皮層內，后侵入黏膜下間質，逐步進展為腫瘤侵入陰道及生殖器官。其早期癥狀與宮頸炎相似，表現為陰道接觸性出血及陰道排液增多，后期則表現為輸尿管梗阻、腎盂積水，嚴重時可引發(fā)尿毒癥。性生活過早、患有性傳播疾病、病毒或真菌感染等均是其危險因素。晚期及復發(fā)宮頸癌患者通常采用以化療為主的非手術治療方式。癌細胞在順鉑的長期作用下，會產生抵抗適應性反應，順鉑對癌細胞的細胞毒性降低，產生耐藥性。目前關于宮頸癌細胞順鉑耐藥機制尚不明確，通常認為與DNA修復功能增強、順鉑在癌細胞內積累過少、抗凋亡相關通路激活及細胞自噬功能減弱有關。因此，探尋宮頸癌細胞化療耐藥性的原因，尋找有效提升順鉑敏感性的治療手段，對于提高化療成功率、改善患者預后意義重大。

順鉑類化療藥物為攻伐之品，易耗氣傷陰，導致臟器虧損、脾胃虛弱、氣血不足等證，雖然抑制了腫瘤生長，但對機體也造成損傷。近年來發(fā)現的抗癌新藥物大多與中草藥有關，部分中草藥提取物可發(fā)揮抗腫瘤及改善腫瘤細胞耐藥性的功效，已成為臨床研究熱點。青風藤是《本草綱目》《本草圖經》等多個古代醫(yī)書記載的傳統(tǒng)中草藥，取自防己科植物青藤、毛青藤藤莖，性平，味苦、辛，歸肝、脾經，可舒筋活血，正骨利髓。青藤堿是其主要活性物質，具有抗癌、抗病毒、抗血管生成、保護器官損傷等作用。本研究結果顯示，與對照組比較，青藤堿組不同順鉑濃度對細胞增殖抑制率、IC均升高，凋亡率升高，提示青藤堿可減弱宮頸癌細胞化療耐藥性，促進細胞凋亡。Chen等研究認為，青藤堿通過激活細胞凋亡相關信號通路，減弱人膀胱癌253J細胞化療多藥耐藥性，本研究結果與其相似。

Notch信號通路是機體內高度保守的信號通路，由受體、配體、DNA結合蛋白及效應分子組成，參與增殖、凋亡等細胞生物學過程，Notch1是其受體蛋白，與Notch配體結合后被金屬蛋白酶分解生成亞基NEC，在γ-分泌酶的作用下，產生Notch胞內段，其直接進入細胞核與轉錄因子結合，作用于下游靶基因Hes1，促進其轉錄，從而發(fā)揮其生物學效應。STAT家族是JAKs下游底物蛋白，主要存在于細胞質中，作為關鍵激活轉錄因子參與癌細胞增殖、自噬、凋亡等多種生理過程，STAT3是細胞信號傳導與激活轉錄因子，廣泛分布于多種細胞質中，被細胞因子受體激活后形成二聚體，轉移至細胞核與相關基因序列結合，轉錄下游靶基因，與Notch信號通路串聯，共同作用調控腫瘤細胞化療敏感性。有研究表明，下調STAT3、Notch1基因可提高耐藥性MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞系化療敏感性。本研究結果顯示，與對照組比較，青藤堿組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達量降低，且在青藤堿的基礎上增加Notch通路特異性激活劑Jagged1蛋白可減弱青藤堿對宮頸癌細胞的化療增敏作用，提示青藤堿可能通過介導該通路，促進細胞凋亡，從而降低宮頸癌細胞化療耐藥性。

綜上所述，青藤堿可提高化療藥物對宮頸癌細胞的增殖抑制率，并促進其凋亡，從而減弱宮頸癌細胞化療耐藥性，可能通過抑制Notch1/STAT3信號通路來實現。