王 萌，胡金朋，王振國，滕 川

膽囊癌(gall bladder cancer，GBC)是一種總體發(fā)病率較低但預(yù)后較差的惡性疾病，5 年生存率約為5%。由于GBC的發(fā)病隱匿、進展迅速、侵襲性高，大多數(shù)患者錯過了手術(shù)機會，即使行根治性手術(shù)，大多數(shù)患者仍會因早期轉(zhuǎn)移和輔助治療有限而復(fù)發(fā)。近年來，膽道系統(tǒng)癌癥的綜合基因組分析取得了重大進展，成纖維細胞生長因子受體 (fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR) 家族是細胞表面受體酪氨酸激酶，通過與其配體成纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor，F(xiàn)GF) 相互作用廣泛參與細胞增殖、分化和遷移。然而，F(xiàn)GFR4的致癌作用仍存在爭議，涉及FGFR4的腫瘤進展的分子機制尚不清楚，直到 2015 年才研究出 FGFR4的特異性抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p可能在GBC-SD細胞中抑制FGFR4表達。Tian等發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p/FGFR4軸可促進肝星狀細胞活化。因此，本研究旨在探究miR-7-5p/ FGFR4軸與GBC預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016-06至2018-06武警特色醫(yī)學(xué)中心普外科行手術(shù)切除的GBC患者47例，收集膽囊癌組織(GBC組)及癌旁組織(PCLT組)，再選取同期良性膽囊疾病患者43例，收集良性膽囊組織(NC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查證實為膽囊癌；(2)術(shù)前常規(guī)檢查結(jié)果正常，無膽囊癌根治術(shù)禁忌；(3)患者和家屬對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)失訪或中途退出。隨訪25～64個月，平均(41±15)個月。47例GBC患者中，男23例，女24例，年齡36～78歲，平均(60.31±10.35)歲；43例良性膽囊患者中，男22例，女21例，年齡32～79歲，平均(58.43±11.26)歲，兩組性別年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：201605001)。

1.2 試劑 trizol提取試劑盒、實時熒光定量 PCR 試劑和試劑盒購自賽默飛世爾科技(上海)公司。

1.3 實時定量PCR 使用trizol提取總mRNA，按照表1中列出的靶基因特異性引物的序列，使用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒進行cDNA的合成，SYBR Green實時PCR預(yù)混試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄酶qPCR分析， StepOnePlus實時熒光定量PCR儀實時定量PCR，實時PCR數(shù)據(jù)分析以β-actin為內(nèi)參，采用2法分析。

表1 實時PCR中使用的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 miR-7-5p、FGFR4在非膽囊癌組織、癌旁組織和膽囊癌組織表達差異及相關(guān)性 與NC組相比， GBC組和PCLT組的miR-7-5p mRNA表達水平下降，F(xiàn)GFR4 mRNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。與PCLT組相比，GBC組的miR-7-5p mRNA表達水平下降， FGFR4 mRNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05，表2)。在NC組中，miR-7-5p mRNA與FGFR4 mRNA相關(guān)(=-0.524，=0.010)，在PCLT組中，miR-7-5p mRNA與FGFR4 mRNA不相關(guān)(=-0.373，=0.055)，在GBC組中，miR-7-5p mRNA與FGFR4 mRNA相關(guān)(=-0.535，=0.004)。

表2 膽囊癌和非膽囊癌患者miR-7-5p/FGFR4 mRNA表達水平

2.2 膽囊癌患者一般資料 47例膽囊癌患者按照FGFR4的表達情況分為低表達亞組(23例)和高表達亞組(24例)，兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性(表3)。兩組的腫瘤分期、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后放化療之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。

表3 膽囊癌患者一般資料 (n;%)

2.3 miR-7-5p/FGFR4 mRNA表達水平與GBC術(shù)后總生存期的關(guān)系 按miR-7-5p表達水平將47例分為miR-7-5p低表達亞組(miR-7-5p Low)23例和miR-7-5p高表達亞組(miR-7-5p High)24例，miR-7-5p低表達亞組生存率低于miR-7-5p高表達亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=-0.726，=0.047，圖1A)；按FGFR4表達水平將47例分為FGFR4低表達亞組(FGFR4 Low)23例和FGFR4高表達亞組(FGFR4 High)24例，F(xiàn)GFR4低表達亞組生存率高于FGFR4高表達亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=2.108，=0.033，圖1 B)。

圖1 膽囊癌患者術(shù)后總生存期

2.4 miR-7-5p及FGFR4的ROC曲線 miR-7-5p的ROC 曲線下面積為0.692(95%：0.538～0.846)，當(dāng)診斷界值確定為0.366時，miR-7-5p 診斷GBC的敏感度為78.3%，特異性為58.3%；FGFR4 的ROC 曲線下面積為0.709(95%：0.555～0.863)，當(dāng)界值確定為0.409 時，F(xiàn)GFR4 診斷GBC的敏感度為82.6%，特異性為58.3%(圖2)。

圖2 膽囊癌患者miR-7-5p及FGFR4的ROC曲線

3 討 論

GBC是膽管最常見的癌癥，由于早期診斷困難，術(shù)前診斷率只有30%，大多數(shù)患者是在手術(shù)時或術(shù)后病理檢查中偶然發(fā)現(xiàn)。對于有癥狀的 GBC即使行R0切除后，5年內(nèi)復(fù)發(fā)的風(fēng)險仍為64%。GBC的臨床預(yù)后很差，雖然在早期(T)手術(shù)的5年生存率可以達到75%，但總體5年生存率低于5%。因此，尋找GBC發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因和相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物，可能對GBC患者診斷和治療提供幫助。

MicroRNA (miRNA) 是約 22 nt 的小非編碼 RNA，在信使 RNA (mRNA) 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用。許多miRNA 可以作為致癌基因或腫瘤抑制基因，miRNA 表達的失調(diào)與癌癥的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。先前有報道稱 MiR-7-5p 是多種癌癥類型中的腫瘤抑制因子，并抑制腫瘤的生長和侵襲。Xiao發(fā)現(xiàn)，MiR-7-5p通過靶向NOVA2抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移。Shi等發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p下調(diào)通過靶向KLF4抑制食管癌的發(fā)生。Yin等發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p通過靶向SATB1抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p在GBC癌旁組織和癌組織中顯著下調(diào)，miR-7-5p低表達患者預(yù)后生存率明顯低于miR-7-5p高表達患者，miR-7-5p表達水平與GBC患者預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系；ROC曲線分析結(jié)果表明，miR-7-5p診斷GBC的敏感度為78.3%，特異性為58.3%，可能為GBC的診斷提供參考。

FGFR4 是 FGFR 家族的成員，包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤血管生成和腫瘤進展中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，F(xiàn)GFR4 在多種實體瘤中過度表達，包括肝細胞癌、乳腺癌、口咽鱗狀細胞癌和胰腺癌等。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4在GBC組織和GBC癌旁組織中高表達，且與抑癌基因miR-7-5p表達水平負相關(guān)。FGFR4 中的遺傳畸變在各種類型的癌癥中普遍存在，基因擴增是所有 FGFR4 基因改變中最常見的改變類型，這些畸變預(yù)示著不良預(yù)后。在本研究中，高表達FGFR4的患者預(yù)后生存率顯著低于FGFR4低表達的患者，與文獻[14]研究結(jié)果一致。FGFR4 診斷GBC的敏感度為82.6%，特異性為58.3%，可能為GBC的輔助診斷提供參考。FGFR4 畸變導(dǎo)致下游信號通路的失調(diào)，如與細胞的增殖、侵襲和凋亡相關(guān)的Ras/Raf/MAPK 和 PI3K-AKT 通路，是兩種在癌癥中經(jīng)常失調(diào)的主要通路。當(dāng)畸變的FGFR4 被激活時，磷酸化的 FGFR4 會募集并磷酸化細胞內(nèi)特異性接頭蛋白，隨后激活 RasRaf-MAPK 通路。另一方面，激活的FGFR4 磷酸化磷脂酶 Cγ，進而激活蛋白激酶 C，隨后刺激Ras/Raf/MAPK 通路。除此之外，F(xiàn)GFR4 通過增強 GSK3β-βcatenin 信號，從而誘導(dǎo) EMT增加。異常激活的 FGFR4可能促進了這些癌癥的形成，F(xiàn)GFR4已成為抑制癌癥發(fā)展的潛在目標(biāo)。

FGFR4 的單一配體結(jié)合域能夠與其特異性配體進行高親和力結(jié)合，這表明有可能開發(fā)出高度特異性的抑制劑。關(guān)于FGFR4的小分子抑制劑的開發(fā)是近幾年才取得突破的。選擇性小分子 FGFR4 抑制劑 BLU9931在肝細胞癌和GBC中表現(xiàn)出顯著的FGFR4 抑制作用，抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。選擇性 FGFR4 靶向已被證明可減少不良反應(yīng)，同時靶向 FGFR4 和其他受體酪氨酸激酶已被證明可通過腫瘤微環(huán)境的正常化間接增強抗腫瘤活性。這進一步證明，F(xiàn)GFR4是GBC治療的靶點，具有十分重要的臨床意義。而以FGFR4為靶點的miRNA的研究有限，Tian等發(fā)現(xiàn)，在肝臟中miR-7-5p可以靶向FGFR4，本研究同樣證實，miR-7-5p和 FGFR4表達負相關(guān)，二者均可作為GBC的診斷的輔助指標(biāo)。因此，本研究推測，對 miR-7-5p/FGFR4軸的進一步研究可能對GBC的治療有一定的幫助。但是，由于本研究的樣本量較小，未來還需要擴大樣本量，關(guān)于miR-7-5p的體內(nèi)實驗尚屬空白，其與FGFR4特異性抑制劑BLU9931的效果差異仍不清楚，未來將進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p/FGFR4軸可能影響GBC的臨床預(yù)后，是未來GBC治療有意義的方向。