劉琦，王仁才，王然

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長沙 410128；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

植物組織培養(yǎng)是植物無性繁殖、基因工程育種、次生代謝物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)等研究與生產(chǎn)的基本技術(shù)手段。最早關(guān)于體細(xì)胞無性系變異的報(bào)道是在甘蔗離體繁殖過程中，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和同工酶譜方面均有變異發(fā)生[1]。后來Larkin等[2]提出了體細(xì)胞無性系變異(somaclonal variation，SV)的概念，它是指在長期連續(xù)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)的細(xì)胞或植株會產(chǎn)生遺傳物質(zhì)變異或表觀遺傳水平上的變異，是植物組織培養(yǎng)過程中存在的普遍現(xiàn)象,不局限于特定的物種和器官，變異種類及所涉及的性狀也相當(dāng)廣泛[3-4]。目前已經(jīng)在150種園藝作物的約1 700個(gè)品種中有相關(guān)變異的報(bào)道[5]，如玫瑰[7]、蝴蝶蘭[8]、花葉芋[9]等觀賞植物，香蕉[10]、草莓[11]等經(jīng)濟(jì)作物以及紅薯[12]、水稻[13]、小麥[14]等糧食作物。體細(xì)胞無性系變異一方面不利于保持無性系后代的遺傳一致性，而另一方面這種高頻率變異也為新品種選育提供了新來源[15]。

1 體細(xì)胞無性系變異的類型

1.1 表型和生理特征的變異

體細(xì)胞無性系變異會使植株的表型特征發(fā)生明顯變化，如葉形、葉色、花形、花色、株高、果形等方面會發(fā)生明顯改變[16-18]。例如，通過愈傷組織再生的文心蘭，變異株葉片呈現(xiàn)黃色條紋狀[19]。在棗椰樹的組織培養(yǎng)株系中，出現(xiàn)了白化葉片和扭曲變形的嫩梢[20]。經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生的菊花無性系花盤大小和花瓣顏色均出現(xiàn)了變異[21]。除表型變化外，在不斷添加外源激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的無性系體內(nèi)激素含量或某些代謝產(chǎn)物含量也會發(fā)生變化。連續(xù)繼代培養(yǎng)的馬尾松組培苗，不同代數(shù)的內(nèi)源激素含量差異明顯[22]。在龍眼細(xì)胞培養(yǎng)過程中檢測到黃酮類物質(zhì)、蘆丁和表兒茶素含量發(fā)生了變化[23]，說明變異株和正常株之間存在生理代謝方面的差異。

1.2 染色體變異

1.2.1 染色體數(shù)目變異

在植物組織培養(yǎng)過程中，細(xì)胞有絲分裂是外植體的脫分化、再分化及再生器官生長的基礎(chǔ)。而在細(xì)胞快速進(jìn)行有絲分裂過程中紡錘絲牽引姐妹染色單體到細(xì)胞兩極時(shí)，有時(shí)會出現(xiàn)錯(cuò)誤，使染色體未能正常分裂到兩個(gè)子細(xì)胞，導(dǎo)致了后代子細(xì)胞的整倍或非整倍性的染色體數(shù)目變異[24]。對荔枝的愈傷組織、胚狀體、組培苗根尖的染色體數(shù)目檢測均發(fā)現(xiàn)了染色體數(shù)目變異的細(xì)胞[25]。在紅核龍眼的愈傷組織培養(yǎng)過程中也檢測到染色體數(shù)目異常的細(xì)胞，出現(xiàn)了多倍化細(xì)胞[26]。由大蒜愈傷組織再生的植株除二倍體外，出現(xiàn)了多倍體和超倍體[27]。在香蕉的胚性懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞染色體數(shù)目從6個(gè)到116個(gè)不等，為整倍體和非整倍體組成的混倍體[28]?？Х鹊呐咝詰腋〖?xì)胞經(jīng)過長期繼代培養(yǎng)后，出現(xiàn)了染色體數(shù)目異常的非整倍體再生植株[29]。因此，經(jīng)過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和愈傷組織的植株再生過程可能更易誘發(fā)染色體數(shù)目變異。

1.2.2 染色體結(jié)構(gòu)變異

染色體結(jié)構(gòu)變異指細(xì)胞在有絲分裂后期染色體兩個(gè)著絲粒向兩極移動(dòng)形成染色體橋，染色體橋的隨機(jī)斷裂會導(dǎo)致染色體發(fā)生缺失、重復(fù)、易位和倒位等[30]。有研究報(bào)道經(jīng)過愈傷組織再生的玉米植株出現(xiàn)了染色體斷裂現(xiàn)象[31]。百合組織培養(yǎng)過程中存在一定的染色體結(jié)構(gòu)變異，在繼代培養(yǎng)8次后異型核種類和數(shù)量增加[32]。經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的黑麥再生植株存在多種染色體結(jié)構(gòu)變異，包括倒位、斷裂、凝聚、雙著絲點(diǎn)等[33]。已有的研究報(bào)道說明，組織培養(yǎng)的特定條件下，細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)變異較在自然條件下發(fā)生頻率更高、更為多樣。這可能是由于離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在DNA復(fù)制和染色體分裂時(shí)對環(huán)境脅迫的緩沖能力變?nèi)酰瑥亩鴮?dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)更易發(fā)生變異[27]。

1.3 DNA序列變異

DNA序列變異包括單堿基突變[34]，核苷酸的插入或缺失[35]等，這在植物的組織培養(yǎng)過程中也是常見的。如由玉米胚培養(yǎng)的再生植株中檢測到有乙酰脫氫酶位點(diǎn)發(fā)生了變異，對該變異基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，密碼子GAG中的A轉(zhuǎn)換為T，使肽鏈中原來的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸[36]。利用現(xiàn)代的分子標(biāo)記和全基因組測序技術(shù)使體細(xì)胞無性系發(fā)生的DNA序列變異更容易被發(fā)現(xiàn)。有研究對擬南芥再生的表型變異株進(jìn)行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，單堿基替換是最常見的核苷酸變化類別[37]。經(jīng)過5個(gè)月懸浮細(xì)胞培養(yǎng)后再生的水稻，發(fā)生單核苷酸變異(single nucleotide polymorphism，SNP)頻率為1.74×10-6[38]。

1.4 表觀遺傳學(xué)變異

在植物組織培養(yǎng)過程中，有些無性繁殖后代出現(xiàn)的變異性狀是由于表觀遺傳變異引起的，這些變異有些是可以遺傳的，也有些是不穩(wěn)定的或可逆的，即回復(fù)突變。表觀遺傳學(xué)變異主要有DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA(miRNA)的調(diào)控[39]。

1.4.1 DNA甲基化狀態(tài)的改變

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，DNA的某些區(qū)域結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)的表觀遺傳修飾過程。DNA甲基化可以通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用或通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來影響基因的表達(dá)[40-41]，在細(xì)胞分化和抵抗外界脅迫等方面起著重要作用[42-44]。如長期培養(yǎng)的擬南芥懸浮細(xì)胞，其再生不定芽能力喪失，研究表明其DNA發(fā)生了超甲基化[45]。研究表明，在植物組織培養(yǎng)過程中，繼代時(shí)間、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度等因素均可能引起DNA甲基化水平的變化[46-47]。例如火龍果組培苗的DNA甲基化水平隨繼代次數(shù)的增加而升高[48]。經(jīng)過組織培養(yǎng)后移栽的菠蘿，出現(xiàn)條紋葉的變異株經(jīng)檢測甲基化水平升高[49]。離體繁殖的新西蘭輻射松(PinusradiataD. Don)DNA甲基化水平升高，導(dǎo)致植株生長勢和再生能力增強(qiáng)[50]。有研究發(fā)現(xiàn)，油棕?zé)o性系隨著離體保存時(shí)間的延長，其DNA甲基化水平降低，產(chǎn)生“Mantled”變異，變異的油棕果雄蕊被類心皮結(jié)構(gòu)取代，導(dǎo)致果皮含油量顯著降低[51]。

1.4.2 組蛋白修飾

組蛋白是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組分，染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，每個(gè)核小體由146個(gè)堿基對的DNA鏈和H2A、H2B、H3、H4四種組蛋白的八聚體組成[52]。組蛋白修飾是組蛋白發(fā)生乙?；?、磷酸化、泛素化等修飾過程，是影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要調(diào)控機(jī)制和基因表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵[53-54]。新西蘭輻射松的組蛋白H4和H3K4me3的乙?；缴撸瑢?dǎo)致針葉細(xì)胞的全能性增強(qiáng)[50]。組蛋白修飾在維持植物基因組穩(wěn)定、調(diào)控基因表達(dá)、促進(jìn)離體再生等方面發(fā)揮了重要作用。例如在擬南芥離體再生過程中，與分化相關(guān)的基因Wus(wuschel)的表達(dá)受到了組蛋白修飾的調(diào)控，使組織培養(yǎng)的組織保持細(xì)胞全能性[55]。在離體培養(yǎng)的煙草細(xì)胞有絲分裂過程也存在組蛋白修飾，如果在培養(yǎng)基中添加組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACIs)等化學(xué)物質(zhì)可以抑制組蛋白脫乙酰酶，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯，說明組蛋白修飾會導(dǎo)致有絲分裂過程發(fā)生變異[56]。

1.4.3 miRNA的調(diào)控

在植物不同類型的RNA中，miRNAs在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對基因沉默起著重要的作用，是植株生長發(fā)育和產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)調(diào)控基因表達(dá)的重要因子。同時(shí)miRNAs也能夠調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)中的胚胎發(fā)生、分生組織形成和器官發(fā)生等過程，突變與miRNA生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因會導(dǎo)致胚胎發(fā)生和分生組織發(fā)育缺陷[57]。在離體再生過程中，生長素和特異性miRNAs是胚胎形成和體細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育的兩個(gè)必要條件[58]。在不同的培養(yǎng)基成份、溫度和環(huán)境條件下，對于難再生的物種可通過調(diào)控其miRNAs的表達(dá)實(shí)現(xiàn)離體再生。對擬南芥的研究表明，miRNAs能夠?qū)ιL素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起作用，生長素響應(yīng)因子(auxin response factor，ARF)與miRNA390之間存在反饋調(diào)節(jié)作用，控制植物器官形成[57]。

1.4.4 轉(zhuǎn)座子的激活

轉(zhuǎn)座子(transposable element，TE)又稱跳躍基因，是一種能夠自主復(fù)制和移位、對基因起到調(diào)控作用的DNA序列。在大多數(shù)植物基因組中，轉(zhuǎn)座子占了很大的一部分，最早是在玉米中發(fā)現(xiàn)的[59]。一般當(dāng)外界環(huán)境改變或植物生理狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)會發(fā)生轉(zhuǎn)座子激活現(xiàn)象。在玉米的體細(xì)胞無性系中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子激活，可導(dǎo)致染色體斷裂[60]。大多數(shù)轉(zhuǎn)座元件在愈傷組織形成期間是被激活的，長期的愈傷組織培養(yǎng)會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。長期繼代保存(約30 a)的伏令夏橙愈傷在培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)座子發(fā)生了轉(zhuǎn)座激活現(xiàn)象，單套染色體轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)隨著愈傷倍性增加而增加，研究同時(shí)證明，低溫保存也是引起轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座激活的因素之一[61]。在組織培養(yǎng)的水稻中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致再生株系發(fā)生體細(xì)胞無性系變異[62]。轉(zhuǎn)座子區(qū)域存在一定程度的DNA甲基化，單拷貝序列的甲基化模式改變，可能會引起體細(xì)胞無性系變異[63]。

2 影響細(xì)胞無性系變異的因素

細(xì)胞無性系變異的發(fā)生通常受外植體本身的基因型和組織培養(yǎng)的環(huán)境因素的影響。在植物組織培養(yǎng)過程中常用的消毒劑、高濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑(主要是生長素和細(xì)胞分裂素)、代替碳源的蔗糖等培養(yǎng)基附加成分、人為設(shè)定的培養(yǎng)基滲透勢、人工光源、密閉容器內(nèi)的高濕環(huán)境和某些氣體成分的過量累積等，均可在一定程度上看作是對植物體的一種脅迫。這種脅迫能夠促使植株產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致植物組織體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫含量升高[64-65]。這些活性氧物質(zhì)能夠分解蛋白質(zhì)及引起遺傳物質(zhì)等的改變，因此，刺激植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的培養(yǎng)條件都能導(dǎo)致變異的發(fā)生[66]。

2.1 外植體的影響

2.1.1 外植體的基因型

外植體的基因型是體細(xì)胞無性系變異的內(nèi)在因素，不同基因型的外植體，其發(fā)生變異的類型和頻率不同。在百合再生植株發(fā)生染色體數(shù)目變異時(shí)，淡黃花百合的變異類型為三倍體和四倍體，而山丹百合的變異類型只有三倍體[32]。用蝴蝶蘭原球莖進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，‘F607’‘P. Little Mary’等品種花瓣和花序出現(xiàn)了明顯的變異，變異率最高可達(dá)47.9%，而‘Annie’‘Taisuco Hatarot’等品種則沒有出現(xiàn)任何變異[67]。另外，植物培養(yǎng)材料的遺傳穩(wěn)定性還受到外植體是否已經(jīng)存在細(xì)胞突變的影響，盡管這些變異不一定表現(xiàn)出任何可見的變異性狀。這種外植體常是變與未變的細(xì)胞或組織以嵌合體的狀態(tài)存在，離體培養(yǎng)只是為之前預(yù)先存在的變異表現(xiàn)提供了條件。例如在有刺嵌合體黑莓的離體再生植株中，出現(xiàn)了無刺或短刺的植株[68]。

2.1.2 外植體的類型及生理狀態(tài)

外植體的類型不同，產(chǎn)生變異的頻率也不同。對莖尖、腋芽和分生組織的培養(yǎng)要比葉、根等成熟器官的組織培養(yǎng)產(chǎn)生的變異少[69]。利用菠蘿‘Mitsubishi’品系的頂芽、腋芽和果實(shí)分別誘導(dǎo)出愈傷組織，經(jīng)長期的繼代培養(yǎng)后誘導(dǎo)再生植株。其中以頂芽為外植體的再生植株變異率為7%，而以腋芽為外植體的變異率達(dá)34%[70]。細(xì)胞無性系變異的頻率與外植體的生理狀態(tài)密切相關(guān)，越衰老的部位產(chǎn)生變異的概率越大。以成熟胚、幼胚為外植體進(jìn)行水稻組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，成熟胚的變異率最高[71]。

不同的增殖培養(yǎng)方式，遺傳穩(wěn)定性不同，由高到低依次為莖尖或莖段(帶腋芽)培養(yǎng)、不定芽再生、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、愈傷組織器官發(fā)生、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)等。莖尖分生組織一般為半球形穹頂狀結(jié)構(gòu)、具有持續(xù)或周期性分裂能力的細(xì)胞群，所以以莖尖進(jìn)行無性繁殖穩(wěn)定性最高，很少發(fā)生變異[52]。而通過愈傷組織器官再生時(shí)，無序愈傷組織細(xì)胞團(tuán)在外源生長調(diào)節(jié)劑的作用下進(jìn)行快速細(xì)胞分裂，此時(shí)的DNA復(fù)制常導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，增加了體細(xì)胞無性系變異的幾率。有研究發(fā)現(xiàn)，月季的離體葉片通過器官發(fā)生途徑再生得到的植株，發(fā)生了明顯的DNA甲基化水平變化[72]。利用黃瓜的葉片直接再生、愈傷組織器官再生及胚性愈傷懸浮液再生3種培養(yǎng)方式獲得的再生株系，經(jīng)全基因測序及數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷懸浮液再生株系單核苷酸變異和小片段的插入位點(diǎn)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于另外兩種途徑再生的株系[73]。

2.2 培養(yǎng)基成分的影響

2.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑(plant growth regulators，PGRs)作為培養(yǎng)基的重要添加成分，能夠影響細(xì)胞周期，對組織或器官的分化具有重要調(diào)控作用。同時(shí)，植物生長調(diào)節(jié)劑可以直接誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異，或通過增加增殖率和誘導(dǎo)不定芽間接誘導(dǎo)變異的發(fā)生[68]。在培養(yǎng)基中添加一種激素和混合多種激素對無性系的誘變率是不同的，多種激素的混合使用，細(xì)胞無性系變異發(fā)生的概率更高[74]。

常見的幾種能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異的生長素類如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)和細(xì)胞分裂素類6-芐基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、合成苯基脲衍生物(phenyl urea derivative，PUD)等。生長素類生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體脫分化、愈傷組織培養(yǎng)、芽增殖與生長及根誘導(dǎo)等過程中是必不可少的，但同時(shí)也增加了變異頻率。對非洲紫羅蘭進(jìn)行葉片再生時(shí)，添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基能夠使體細(xì)胞無性系變異頻率顯著增加[74]。研究發(fā)現(xiàn)，在組織培養(yǎng)過程中加入2,4-D對外植體的脫分化、胚性細(xì)胞的形成及愈傷組織的誘導(dǎo)等有重要促進(jìn)作用[75]，同時(shí)添加2,4-D會影響內(nèi)源生長素的極性運(yùn)輸，打破體細(xì)胞胚的穩(wěn)定性，造成變異[76-78]。例如，添加2,4-D的培養(yǎng)基培養(yǎng)的獼猴桃胚性愈傷組織再生植株出現(xiàn)了異常表型[79]。表觀遺傳學(xué)方面發(fā)生的變化也一定程度上歸因于2,4-D的使用，2,4-D會導(dǎo)致DNA甲基化的發(fā)生，明顯提高變異頻率[80-81]。在香蕉的愈傷組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，添加生長素2,4-D導(dǎo)致甲基化水平升高，特別是胞嘧啶甲基化，導(dǎo)致了組織培養(yǎng)植株的變異[82]。

外源細(xì)胞分裂素的添加也誘導(dǎo)了體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生，最常用的為6-BA和噻苯隆(thidiazuron，TDZ)。TDZ是一種人工合成的、高效的生長調(diào)節(jié)劑，在不定芽增殖、體細(xì)胞胚發(fā)育、離體再生和組培植株開花方面起關(guān)鍵作用[83]。TDZ能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生許多形態(tài)上的變化，如在杏[84]、白鶴芋[85]、香蕉[86]等植物上有研究報(bào)道，能夠?qū)е氯~形態(tài)異常，嫩枝扁化和芽基膨大等變異。最新的研究表明TDZ用于中草藥作物的組織培養(yǎng)時(shí)，能夠影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[83,87-88]。

在油棕的體細(xì)胞無性系變異研究中發(fā)現(xiàn)，生長素和細(xì)胞分裂素的不同濃度配比也影響著變異的發(fā)生。油棕組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中生長素/細(xì)胞分裂素濃度配比相對較高時(shí)，油棕發(fā)生‘Mantled’變異的概率較低，細(xì)胞分裂素/生長素濃度配比較高時(shí)，‘Mantled’發(fā)生率顯著升高[89]。

2.2.2 其他培養(yǎng)基添加劑

培養(yǎng)基中除添加碳源、無機(jī)鹽、生長調(diào)節(jié)劑等植物生長必須的營養(yǎng)元素外，在實(shí)際生產(chǎn)上還會添加抗乙烯化合物硝酸銀等其他添加劑，這些添加劑也能誘導(dǎo)細(xì)胞無性系變異的發(fā)生。在辣木的組織培養(yǎng)過程中添加硝酸銀(AgNO3)以減輕組培植株玻璃化，但經(jīng)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeat，ISSR)兩種分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)生了體細(xì)胞無性系變異[90]。在白梨的培養(yǎng)基中添加FeSO4替代EDTA-Fe螯合劑產(chǎn)生了耐高鐵的株系，對變異株系進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)了特異性條帶[93]。

2.3 組織培養(yǎng)條件的影響

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間和繼代次數(shù)

通常情況下，增加繼代次數(shù)和持續(xù)組織培養(yǎng)的時(shí)間(特別是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng))能夠增加細(xì)胞無性系變異發(fā)生的頻率[94-95]。在組織培養(yǎng)過程中，較高的芽增殖率和繼代頻率導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)可能會出現(xiàn)錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致發(fā)生變異。香蕉持續(xù)繼代培養(yǎng)的植株與短期培養(yǎng)的植株相比，發(fā)生變異的頻率更高[96]。利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對不同培養(yǎng)時(shí)間的紅花愈傷組織進(jìn)行檢測，隨著繼代次數(shù)的增加，測到的多態(tài)性條帶增加，說明隨著繼代次數(shù)的增加體細(xì)胞無性系變異發(fā)生的頻率增加[62]?；瘕埞谒拇卫^代培養(yǎng)的苗出現(xiàn)了矮化和桿棱數(shù)量增多的突變體，植株變異頻率高達(dá)24%[95]。同時(shí)也有研究表明，經(jīng)過長時(shí)間培養(yǎng)的植物組織，器官發(fā)生能力和再生能力會發(fā)生改變[96]。長期培養(yǎng)的咖啡愈傷組織在培養(yǎng)最初的27個(gè)月內(nèi)可以再生，但是在連續(xù)組織培養(yǎng)36個(gè)月后，再生能力喪失[97]。

2.3.2 光質(zhì)和光照強(qiáng)度

在組培環(huán)境中通常使用人工光源來模擬植物在自然生長條件下的光照強(qiáng)度和光周期，體細(xì)胞無性系變異受到不同波長和不同強(qiáng)度光源的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)植物的各種形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和生理屬性，如葉片形態(tài)、芽的伸長、腋芽的形成、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、生根能力和光合能力等，均受到LED的光譜特性的調(diào)控。藍(lán)光LED處理龍眼胚性愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，光源波長通過多個(gè)miRNA影響基因表達(dá)，造成類黃酮的積累[98]。在番茄的組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)與正常光照相比，紅光LED光照下植物的生長發(fā)育發(fā)生了多種形態(tài)和生理參數(shù)的變化[99]。在木瓜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的LED光源促進(jìn)了蛋白質(zhì)的差異積累，影響體細(xì)胞胚的再生率[100]。

2.4 植物組織培養(yǎng)材料的人工誘變

誘變處理指的是對植株或者植物的細(xì)胞組織使用物理誘變或者化學(xué)誘變劑，使植株發(fā)生基因突變，再進(jìn)行一定的抗性篩選以此選育出優(yōu)良的突變體。為了提高植物變異的頻率，創(chuàng)造更多的突變體，以利于抗性突變體或新品種的選育，常用人工誘變的方法對培養(yǎng)的材料進(jìn)行誘變。

2.4.1 物理誘變

物理誘變是利用物理因子對培養(yǎng)材料進(jìn)行的遺傳變異的誘變，目前應(yīng)用較多的是輻照誘變。輻照誘變是使用一定劑量的物理射線來照射植株或愈傷組織等，誘導(dǎo)其發(fā)生遺傳性的變異，再經(jīng)過人工定向篩選鑒定，獲得所需突變體。例如用60Co射線處理溝葉結(jié)縷草的愈傷組織后經(jīng)過一定的壓力篩選，選育出具有抗草甘膦的結(jié)縷草突變體[101]。用不同強(qiáng)度的60Co射線輻照甘蔗的帶芽莖段，半致死劑量25 Gy輻照的甘蔗分蘗數(shù)、高度、重量和可溶性固形物的含量顯著增加[102]。

2.4.2 化學(xué)誘變

常用的化學(xué)誘變劑有秋水仙素、甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)、加硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)、疊氮化鈉等。其中，由于秋水仙素能夠抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘絲的形成，常常用于多倍體材料誘導(dǎo)。用15、30、60、120 mg/L濃度的秋水仙素處理蘋果離體葉片，均獲得了同源四倍體植株[103]。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%的秋水仙素通過混培法處理獼猴桃葉片，誘導(dǎo)出四倍體植株[104]。此外，由于EMS高頻、高效、范圍廣、點(diǎn)突變多及產(chǎn)生染色體畸形概率小的誘變效果，在黃瓜的育種上通常利用EMS誘變的方法創(chuàng)造新種質(zhì)[105]。

3 變異的檢測與鑒定

在離體培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生變異的數(shù)量比在自然栽培的植物種群中更大，也更容易被發(fā)現(xiàn)，如果在組織培養(yǎng)過程中較早的檢測出變異，可減少不良變異對生產(chǎn)造成的損失。目前對于體細(xì)胞無性系變異的檢測與鑒定，主要通過形態(tài)學(xué)評估、生理生化指標(biāo)檢測、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)方面進(jìn)行鑒定。

3.1 形態(tài)學(xué)評估

形態(tài)學(xué)評估是對植株表型進(jìn)行量化，如植物的株高、莖粗、葉面積、形狀、果實(shí)質(zhì)量、果形指標(biāo)和果色有無異常，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析有無明顯差異。對無性系進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估是檢測細(xì)胞無性系變異最直觀、最簡便的方法。對再生植株的表型檢測已用于很多植物上。如芭蕉屬植物最常見的變異表型為植株的矮化[106]。經(jīng)過長期培養(yǎng)的胚性愈傷再生的橄欖植株中也發(fā)現(xiàn)了明顯與生長有關(guān)的表型變異，包括株高、冠層體積、葉面積和果實(shí)大小[52]。經(jīng)葉片再生獲得的櫻桃無性系群體也表現(xiàn)了葉片形態(tài)以及果實(shí)大小、形狀和顏色等形態(tài)學(xué)差異[107]。

但對多年生作物的表型可能需要很多年才能表現(xiàn)出來，要觀察其開花結(jié)果的表型有無變化甚至需要更長的時(shí)間，所以通過形態(tài)學(xué)方法檢測和評估果樹這類多年生作物的變異是非常耗時(shí)的[108]。另外，植物的表型是基因型和外界環(huán)境共同作用的結(jié)果，有些遺傳變異表型可能不明顯，也有些表型明顯的變異僅僅是因?yàn)榄h(huán)境的影響，而非遺傳物質(zhì)的變異。因此，形態(tài)學(xué)評估的方法檢測細(xì)胞無性系變異也存在一定的局限性。

3.2 生理生化指標(biāo)的檢測

在組織培養(yǎng)的任何階段都可以進(jìn)行生理生化方面的指標(biāo)檢測，這也是檢測體細(xì)胞無性系變異的常用手段。在研究培養(yǎng)時(shí)間對紅花遺傳變異的影響時(shí)，采用酶聯(lián)免疫法測定內(nèi)源激素含量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至4～6代時(shí)植株體內(nèi)生長素(indole-3-acetic acid，IAA)含量較高，赤霉素(gibberellin，GA)含量較低[22]?；诖x物來分析變異也是常用的。例如在香蕉無性繁殖過程中出現(xiàn)的矮化株，通過對變異株和正常植株的氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)代謝物譜進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，有82種代謝物差異顯著且鼠李糖只存在于矮生株中。其他一些葉綠素、類胡蘿素和花青素等代謝產(chǎn)物，也可以作為體細(xì)胞無性系變異的檢測指標(biāo)[17]。生理生化檢測的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、檢測指標(biāo)多，有些情況下檢測的指標(biāo)并不能準(zhǔn)確的確定變異的存在。

3.3 細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定

細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定主要觀察染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變化，一般采用細(xì)胞顯微技術(shù)(染色體壓片法、去壁低滲火焰干燥法等)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，染色體有絲分裂和減數(shù)分裂行為、結(jié)構(gòu)的觀察。對細(xì)胞染色體倍性判斷更為快捷、準(zhǔn)確的方法是流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是通過對整個(gè)細(xì)胞或原生質(zhì)體的細(xì)胞核中DNA進(jìn)行特異性的熒光染料染色，來進(jìn)行DNA含量分析，是一種非常有用的評估植物材料倍性的方法。與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法(如染色體計(jì)數(shù))相比，使用流式細(xì)胞儀在擬南芥的愈傷組織中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了二倍體和四倍體[109]，在木槿[110]、香菜[111]、紫丁花[112]等多種植物上有應(yīng)用的報(bào)道。

3.4 分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)利用特異性引物擴(kuò)增基因組堿基序列，通過比對有無多態(tài)性條帶直接反應(yīng)DNA水平的遺傳多樣性。該技術(shù)能夠在組織培養(yǎng)的任何階段進(jìn)行，如果能提早發(fā)現(xiàn)不良變異可以減少不必要的損失，很大程度上推動(dòng)了對細(xì)胞無性系變異的研究，前期研究已經(jīng)應(yīng)用許多分子標(biāo)記技術(shù)檢測到變異植株與原始植株基因序列之間的差異。常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STRs等，可以使用一種分子標(biāo)記技術(shù)，也可以結(jié)合多種分子標(biāo)記技術(shù)來檢測細(xì)胞無性系變異[93,113]。對離體繁殖的草莓進(jìn)行遺傳變異的研究中使用了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)[114]。在近些年的研究中使用ISSR和PAPD兩種分子標(biāo)記技術(shù)最為常見[115]。例如有利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對康乃馨再生植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，但未檢測到變異[116]。Vos等[117]用ISSR，RAPD和MS-ISSR 3種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了巨芒草無性系的遺傳穩(wěn)定性評估。

在表觀遺傳方面通常采用甲基化敏感性擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)技術(shù)評估無性系基因組的甲基化水平。MSAP實(shí)際上是對AFLP技術(shù)的一種改進(jìn)，其中甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶(同工酶HpaII和MspI)對甲基化胞嘧啶具有不同的敏感性，并產(chǎn)生可識別甲基化DNA位點(diǎn)[118]。MSAP技術(shù)被用于檢測咖啡和油棕等作物的體細(xì)胞無性系變異[119-120]。

3.5 同工酶標(biāo)記

同工酶標(biāo)記是對基因編碼區(qū)外顯子翻譯成的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析檢測，一直以來都是研究遺傳多樣性和變異的方法，體細(xì)胞無性系變異也可通過同工酶標(biāo)記技術(shù)對克隆蛋白和酶多態(tài)性進(jìn)行分析檢測[121]。植物體內(nèi)有抗氧化防御系統(tǒng)來對抗氧化壓力，從而在脅迫環(huán)境下生存。同工酶標(biāo)記通常測定的酶包括脫氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等[122]。在大豆[123]、馬鈴薯[124]等作物上有用同工酶標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞無性系變異檢測的報(bào)道。

雖然同工酶法檢測遺傳變異實(shí)驗(yàn)操作簡單易行，但是由于其結(jié)果易受個(gè)體發(fā)育和外界環(huán)境的影響，同工酶的種類較少(僅檢測可溶性蛋白)，因此檢測結(jié)果多用于輔助分析。

3.6 基因組測序

全基因組測序技術(shù)是對個(gè)體基因組序列進(jìn)行測序，通過對參考基因組比對的差異信息進(jìn)行分類和注釋。近十年來，隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，全基因組測序技術(shù)成為檢測細(xì)胞無性系變異的新方法。對土豆原生質(zhì)體再生的無性系進(jìn)行全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，與莖段繁殖的植株相比，染色體的某些區(qū)域發(fā)生了較高頻率的變異，從而導(dǎo)致植物表型發(fā)生變化[18]。對于無參考基因組的物種，可以用簡化基因組測序技術(shù)(specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)進(jìn)行全基因組變異率的檢測，例如對文心蘭體細(xì)胞無性系的研究發(fā)現(xiàn)，SNP變異的頻率為1.00×10-3[19]。在黃瓜的無性系變異研究中，利用全基因組測序的方法，發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的黃瓜發(fā)生變異頻率最高的是非編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)，變異位點(diǎn)占所有多態(tài)性的1%～4%。對變異位點(diǎn)基因的功能分析表明，它們與物質(zhì)運(yùn)輸、生物合成和蛋白的修飾過程有關(guān)[131]。

4 細(xì)胞無性系變異在農(nóng)業(yè)育種中的應(yīng)用

4.1 優(yōu)良新品種選育

體細(xì)胞無性系變異在不同的作物中產(chǎn)生了多種類型的變異體，可以將其進(jìn)一步整合到育種程序中，以獲得重要農(nóng)藝性狀。草莓的繁殖多采用莖尖分生組織培養(yǎng)的方法，在這一過程中產(chǎn)生了果實(shí)畸形、糖度改變、產(chǎn)量降低、花期變化等多種變異，育種家們利用草莓的這種變異培育了很多新品種[125]。通過輻照誘變培育出香蕉的早熟品種‘Novaria’[126]。目前采用最多的是通過物理誘變或化學(xué)誘變后施加選擇壓力，以此篩選到抗性優(yōu)良的新品種。通過誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異獲得了對紅腐病、黑穗病具有抗性的甘蔗‘CoA7601’已被推廣種植[127]。在非生物脅迫的抗性育種中，也已經(jīng)利用細(xì)胞無性系變異選育出抗鹽和抗除草劑的優(yōu)良品系，例如，由細(xì)胞系再生出的無性系具有耐鹽性，篩選出耐鹽害小麥突變體[128]，通過對不同鐵濃度脅迫下溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織再生植株生理指標(biāo)的測定，篩選出耐高鐵離子濃度的溝葉結(jié)縷草植株[129]。

體細(xì)胞無性系變異并不局限于任何特定的植物類別，在糧食作物[130]、蔬菜[131]、果樹[132]和林業(yè)樹種[133]以及觀賞植物中都存在廣泛的體細(xì)胞無性系變異。此外，通過體細(xì)胞無性系變異產(chǎn)生的新穎的葉和花，在觀賞植物育種中也具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

4.2 育種應(yīng)用的局限性

由于體細(xì)胞無性系變異發(fā)生的不定向性，發(fā)生的變異也常常會對園藝植物的快速繁殖和實(shí)際生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。通過組織培養(yǎng)的油棕植株普遍存在變異，油棕在發(fā)生“mantled”變異后雄蕊被裂心皮結(jié)構(gòu)覆蓋，導(dǎo)致雌花不能受精，嚴(yán)重影響油棕的產(chǎn)油量[134]，并且這種變異直至開花時(shí)才能被發(fā)現(xiàn)。某些物種的離體培養(yǎng)通常會出現(xiàn)多種不利于生產(chǎn)的變異，例如草莓的離體培養(yǎng)過程中常會發(fā)生葉片畸形、果形變小、幼苗玻璃化或生根異常等不良變異[135]。體細(xì)胞無性系變異的產(chǎn)生僅限于能夠在組培中繁殖并具有再生能力的植物種類。體細(xì)胞無性系變異有時(shí)會降低植株的繁殖能力甚至失去再生能力。另外，木本植物的生命周期很長，體細(xì)胞無性系變異產(chǎn)生不良性狀時(shí)會造成經(jīng)濟(jì)損失[136]，如果想要在大規(guī)模無性繁殖后獲得表型和遺傳性一致的苗木，就必須避免體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生。

不同的影響因素導(dǎo)致了體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生，因此可以通過對這些因素加以控制來減少變異的發(fā)生。其次是尋找簡單易行的檢測手段發(fā)現(xiàn)變異，特別是在分子水平上，從培養(yǎng)早期和不同的培養(yǎng)階段聯(lián)合多種方法進(jìn)行變異檢測和遺傳物質(zhì)分析，盡量減小或避免產(chǎn)生不良變異的影響?？傊?，隨著人們對體細(xì)胞無性系變異研究的深入，對其影響因素和變異規(guī)律以及變異調(diào)控問題的探索，體細(xì)胞無性系變異將在植物新品種選育和品種改良方面有著巨大的應(yīng)用前景。