苗靜波，王燕如，楊勇，張清明

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266109)

收稿日期：2021-08-31

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金(ZR2016CM11)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017GSF21112)

作者簡介：苗靜波(1995—)，男，河北張家口人，在讀碩士，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理與污染修復(fù)。E-mail：1365952338@qq.com

通信作者：張清明(1978—)，男，山東博興人，教授，博士，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理與污染修復(fù)研究。E-mail：qmzhang@qau.edu.cn

咪唑乙煙酸是由美國氰胺公司開發(fā)的咪唑啉酮類除草劑中的一種，通過抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)或乙酸羥酸合成酶(AHAs)的活性，阻礙氨基酸合成使植物停止生長而死亡[1]。咪唑乙煙酸主要用于防治一年生和多年生禾本科與闊葉雜草，因其在大豆體內(nèi)能快速分解，故被廣泛應(yīng)用于大豆田除草[2]，是咪唑啉酮類除草劑在我國銷售的主要商品。但是咪唑乙煙酸在土壤中殘效期長，長期大面積使用不僅會對油菜、水稻、玉米等后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，造成減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)的嚴(yán)重后果[3]，還會影響輪作的正常進(jìn)行，使大豆產(chǎn)量與質(zhì)量顯著下降[4]；土壤中殘留的咪唑乙煙酸還會通過淋溶或揮發(fā)作用對大氣和地下水造成污染[5-7]。除此之外，咪唑乙煙酸的大量使用，還有可能減少生物多樣性、降低土壤質(zhì)量、減少生物固氮等[8]。所以，如何快速、有效、環(huán)保的修復(fù)咪唑乙煙酸殘留污染成為亟待解決地問題。

目前，對咪唑乙煙酸殘留污染的治理方法主要有生物降解和非生物降解[9]，但傳統(tǒng)治理方法往往存在治理周期長、清除速度慢、易造成二次污染等問題，不適宜在大豆田中大面積應(yīng)用。Jerry等[10]利用14C標(biāo)記法研究證明，土壤中的咪唑乙煙酸主要通過微生物降解，而且微生物降解除草劑對環(huán)境污染小，安全性較高，所以分離篩選出能高效降解咪唑乙煙酸的微生物是解決其污染問題的有效途徑[11]。目前已經(jīng)有丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、海球菌屬(Marinococcus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、無色桿菌屬(Photorhabdus)等細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)對咪唑乙煙酸有降解作用[12]。

為了進(jìn)一步豐富咪唑乙煙酸降解菌菌庫，優(yōu)化菌株降解條件，本研究利用高壓富集馴化的方法從山東農(nóng)田土壤中分離篩選出1株可降解咪唑乙煙酸的細(xì)菌(MZ-1)，并對其分類地位和降解特性進(jìn)行了研究。同時(shí)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其對咪唑乙煙酸的降解條件以提高降解效率，并且利用油菜種子作為生物材料，通過比較降解前后的含咪唑乙煙酸培養(yǎng)液對油菜種子的毒性差別，來驗(yàn)證菌株對咪唑乙煙酸的去毒效果，以期為咪唑乙煙酸殘留污染的生物修復(fù)提供材料和方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑及儀器

咪唑乙煙酸原藥(98%)，由山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司提供。甲醇和乙腈均為色譜級，試驗(yàn)中所需的其他試劑均為分析純。

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Vanquish 超高效液相色譜儀和LTQ XL質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司，美國)；恒溫振蕩器(THZ-98AB，上海-恒科)；CP214電子天平(奧豪斯儀器公司，上海)；SevenCompact型pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器公司，瑞士)；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器公司，日本)。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：5 g蛋白胨，5 g酵母粉，1 g K2HPO4，1 g葡萄糖，1 000 mL蒸餾水。

選擇培養(yǎng)基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.1 g 蛋白胨，蒸餾水 1 000 mL。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，0.1 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸餾水。

LB培養(yǎng)基：5 g酵母膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，1 000 mL蒸餾水。

所有培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至7.0，固體培養(yǎng)基添加2.0%的瓊脂粉，并在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。

1.2 降解菌的富集馴化、分離及純化

試驗(yàn)土壤采集于山東某長期施用咪唑乙煙酸的農(nóng)田中，采用逐級加量馴化的方法進(jìn)行高效降解菌的馴化篩選[13]。取5 g土壤加入50 mL LB培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)液10 mL加入100 mL的選擇培養(yǎng)基中(咪唑乙煙酸初始濃度為100 mg/L)培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)接至咪唑乙煙酸濃度更高的選擇培養(yǎng)基中(濃度每次提高100 mg/L)，逐級提高培養(yǎng)基中咪唑乙煙酸的濃度，直至達(dá)到500 mg/L。吸取50 μL上述培養(yǎng)液涂布于咪唑乙煙酸濃度為500 mg/L的固體選擇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)肉眼可見的菌落，挑取菌落進(jìn)一步分離純化，共分離得到4株形態(tài)差異的菌株。采用高效液相色譜法確定純化后的菌株對咪唑乙煙酸的降解能力，選取降解能力最強(qiáng)的降解菌(命名為MZ-1)進(jìn)行后續(xù)的研究，并且采用甘油管冷凍保存法于-20 ℃下保存。

1.3 降解菌MZ-1的鑒定

參照趙婷等[14]的方法，通過形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析對降解菌MZ-1進(jìn)行鑒定。16S rRNA擴(kuò)增序列引物為細(xì)菌通用引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測序，用RNAman拼接，將拼接結(jié)果與Genbank上已公布的基因序列進(jìn)行比較，采用MEGA 7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。所得序列上傳至Genbank獲得序列號為MW541635。

1.4 咪唑乙煙酸降解菌降解率測定

1.4.1 咪唑乙煙酸的提取

參照楊鑫[15]的方法進(jìn)行，取待測培養(yǎng)液5 mL于50 mL離心管中，按培養(yǎng)液與二氯甲烷體積比為1∶4的比例加入二氯甲烷。充分震蕩后，靜置5 min，用移液槍棄去上層水層，將有機(jī)相倒入50 mL圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃蒸發(fā)近干，用5 mL色譜純甲醇反復(fù)潤洗，用1 mL一次性注射器吸取，過0.22 μm濾膜，加入自動進(jìn)樣小瓶待測。

1.4.2 超高效液相色譜檢測條件

參照賈福艷等[16]的方法進(jìn)行，液相色譜柱：Thermo Hypersll GOLD C18 (3 μm, 2.1 × 100 mm)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動相：乙腈與1%冰乙酸體積比為80∶20溶液；檢測波長：254 nm。此條件下，咪唑乙煙酸的保留時(shí)間為1.17 min。

1.4.3 降解菌MZ-1降解性能的測定

將平板上的菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)12 h后，利用紫外分光光度計(jì)測定菌懸液在600 nm處的吸光度(OD600)，用滅菌的新鮮培養(yǎng)液將OD600調(diào)節(jié)至1.0，制成母液，按照5 %接菌量，接種至50 mL基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，其中咪唑乙煙酸初始濃度為200 mg/L，培養(yǎng)溫度 30 ℃，160 r/min，黑暗培養(yǎng)5 d。按照1.4.1方法提取咪唑乙煙酸，按照1.4.2的方法測定咪唑乙煙酸剩余含量，以不接菌培養(yǎng)液作為對照。咪唑乙煙酸降解率的計(jì)算公式[17]：

其中：R為降解率，%；c0為對照培養(yǎng)樣品咪唑乙煙酸殘留量，g/mL；c1為處理樣品咪唑乙煙酸殘留量，g/mL。

1.5 降解菌MZ-1降解條件的優(yōu)化

結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，影響降解菌降解效率的主要環(huán)境因素有pH、溫度、接菌量[18]，采用響應(yīng)面法利用Design-Expert8.0.6 軟件中 Box-Behnken design (BBD)模型進(jìn)行 3 因素 3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對以上3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，以溫度(A)、pH(B)、接菌量(C)為自變量，以5 d后降解率為唯一響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of experiment design

1.6 降解菌Z-1在最優(yōu)條件下生長和降解曲線測定

在最優(yōu)pH、溫度、接菌量的條件下將降解菌MZ-1接種于100 mL的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，咪唑乙煙酸初始濃度為200 mg/L，每隔24 h測定菌液的OD600值和咪唑乙煙酸的降解率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D600值和降解率為縱坐標(biāo)，根據(jù)時(shí)間與OD600值和降解率的對應(yīng)關(guān)系繪制降解菌的生長曲線和降解曲線。

1.7 降解菌MZ-1對咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)

采用培養(yǎng)皿濾紙法，測定了菌株MZ-1對油菜的咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)[2]。選取大小均勻一致的油菜種子10粒，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，以滅菌的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)液處理為對照組，將含相同濃度的咪唑乙煙酸培養(yǎng)液分為接菌和不接菌兩組處理，5 d后，分別稀釋10倍、500倍、1 000倍處理種子，30 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后測量根長，計(jì)算各稀釋倍數(shù)咪唑乙煙酸培養(yǎng)處理后對油菜種子根生長的抑制率[19]，每組3次重復(fù)。通過抑制率的大小來評價(jià)菌株MZ-1對咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)。

其中：Y為抑制率，%；g0為對照組總根長，cm；g1為處理組總根長，cm。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，并進(jìn)行LSD差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)；運(yùn)用Origin 2018和Design-Expert11進(jìn)行繪圖和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌MZ-1鑒定

2.1.1 降解菌MZ-1的形態(tài)及生理生化特性

通過逐級加量馴化的方法，分離篩選出1株對咪唑乙煙酸具有降解能力的細(xì)菌，命名為MZ-1，菌落呈近圓形，灰白色，粗糙無光澤，中央稍凸起，邊緣不整齊，有的呈缺刻狀，在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)生長迅速，常有菌膜或壁環(huán)形成。生理生化特性測定結(jié)果如表2所示：降解菌MZ-1為革蘭氏陽性菌，具芽孢，產(chǎn)生過氧化氫酶和淀粉水解酶，不產(chǎn)生吲哚。

表2 降解菌MZ-1部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of degradation bacteria MZ-1

2.1.2 降解菌MZ-1的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將PCR測序產(chǎn)物拼接后，在GenBank中的注冊號為(MW541635)，經(jīng)過BLAST對比顯示，菌株MZ-1的16S rRNA與蠟狀芽孢桿菌(N999893)相似度為100%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

圖1 降解菌MZ-1的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of degradation bacteria MZ-1 on the 16S rRNA sequence

2.2 降解菌MZ-1降解咪唑乙煙酸響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

綜合考慮各因素對降解菌MZ-1降解咪唑乙煙酸效率的影響，利用響應(yīng)面分析法對降解溫度(A)、pH(B)、接菌量(C)三個(gè)因素分析得到最佳降解條件。菌MZ-1響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。由表3可以看出零點(diǎn)試驗(yàn)點(diǎn)的降解率較穩(wěn)定，在72 %左右。利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行回歸擬合，得到咪唑乙煙酸降解回歸方程：咪唑乙煙酸降解率Y(%)=71.63+4.85 A-9.62 B+2.02 C+5.5 AB-1.47 AC + 2.26 BC - 8.84 A2-

23.56 B2- 4.46 C2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Design results and analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件確定

溫度、pH和接菌量交互作用對咪唑乙煙酸降解率均有顯著影響。當(dāng)接菌量固定時(shí)，隨著溫度和pH的增大，降解率都呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，但隨溫度變化較平緩，說明溫度對降解率影響比pH小，等高線呈閉合的橢圓形說明溫度和pH交互作用明顯(圖2A、2B)；當(dāng)pH固定時(shí)，降解率隨溫度和接菌量的增大，均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，但隨接菌量變化平緩，說明接菌量對降解率影響比溫度小，等高線近圓形，說明溫度和接菌量交互作用不明顯(圖2C、2D)；當(dāng)溫度固定時(shí)，pH和接菌量的等高線呈閉合橢圓形，說明pH和接菌量交互作用明顯(圖2E、2F)。上述分析和表3中方差分析一致。由Design Expert 8.0.6軟件分析計(jì)算，獲得MZ-1降解咪唑乙煙酸的最優(yōu)條件，為了方便操作對所獲得的最優(yōu)條件進(jìn)行了修正：降解溫度為32 ℃，pH為6.6，接菌量為3%，降解率預(yù)測值為73.12%。

圖2 各因素交互作用對降解率影響Fig. 2 Response surface and contour of each factors on degradation of imazethapyr

2.3 最優(yōu)條件下生長和降解曲線測定

在最優(yōu)降解條件下，菌株MZ-1在咪唑乙煙酸濃度200 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，生長快速，24 h時(shí)OD600值達(dá)到最大(圖3)。隨著菌株MZ-1的快速生長，咪唑乙煙酸的降解率逐漸升高，在110 h后，降解率為74.34%，與預(yù)測值偏差為1.64%，進(jìn)一步說明所得優(yōu)化模型能夠較好地預(yù)測菌株對咪唑乙煙酸的降解情況。

圖3 菌株MZ-1在最優(yōu)條件下的生長及降解曲線Fig. 3 Growth and degradation curves of strain MZ-1 under optimal conditions

2.4 降解菌MZ-1對咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)

菌株MZ-1在稀釋倍數(shù)較高時(shí)對咪唑乙煙酸有一定的去毒效應(yīng)(圖4)，稀釋倍數(shù)較低時(shí)，由于咪唑乙煙酸濃度過高，對油菜產(chǎn)生藥害極嚴(yán)重，根生長緩慢，兩組處理的差異不明顯。隨著稀釋倍數(shù)的增加，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，不同處理對油菜種子根生長的抑制率差異顯著。當(dāng)稀釋倍數(shù)為500倍(500×)時(shí)，不接菌處理對油菜根長抑制率為51.95%，接菌處理組對根長抑制率為45.40%，而當(dāng)稀釋倍數(shù)為1 000倍(1 000×)時(shí)，接菌處理組的抑制率為18.91%，僅為不接菌處理抑制率的52.45%。表明降解菌MZ-1能有效降低咪唑乙煙酸對后茬敏感作物油菜的毒性，對咪唑乙煙酸有明顯的去毒效果。

圖4 兩種處理對油菜種子生長的影響Fig. 4 Effects of two treatments on seed growth of rape seeds注：圖中不同字母表示同一稀釋濃度下接菌處理與不接菌處理在p≤0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究篩選出一株對咪唑乙煙酸有降解能力的蠟狀芽孢桿菌MZ-1。利用響應(yīng)面法得到該菌對咪唑乙煙酸的最佳降解條件：溫度為32 ℃，pH為6.6，接菌量為3%，在此最優(yōu)條件下，菌株MZ-1在5 d后對初始濃度為200 mg/L的咪唑乙煙酸預(yù)測降解率為73.12%。經(jīng)過菌株MZ-1對咪唑乙煙酸去毒效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)較高即咪唑乙煙酸濃度較低時(shí)，兩組處理差異顯著，接菌處理組對油菜種子根生長抑制率顯著低于不接菌處理組，表明菌株MZ-1對咪唑乙煙酸殘留毒性有去毒效應(yīng)。

蠟狀芽孢桿菌是一類兼性好氧、能產(chǎn)生抗逆性芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、耐高溫和抗逆性強(qiáng)等特性，是一類重要的資源微生物，在農(nóng)藥及難降解有機(jī)物殘留污染的生物修復(fù)中有十分廣泛的應(yīng)用前景[20]。目前，關(guān)于蠟狀芽孢桿菌降解農(nóng)藥等難降解有機(jī)物的報(bào)道較多，如陳貝貝等[21]，從棉田土壤中分離得到一株蠟狀芽孢桿菌D8，3 d后對氟樂靈的降解率達(dá)59.89%；張成等[22]篩選出一株蠟狀芽孢桿菌WL08，對烯酰嗎啉有較高降解能力，在最優(yōu)條件下游離的WL08在72 h內(nèi)可將初始濃度為50 mg/L的烯酰嗎啉降解66.95%。此外，蠟狀芽孢桿菌對有機(jī)磷農(nóng)藥殘留污染的修復(fù)也有較好效果[23]。本研究分離得到的蠟狀芽孢桿菌對咪唑乙煙酸有較高降解能力，目前未見其他有關(guān)蠟狀芽孢桿菌降解咪唑乙煙酸的報(bào)道。

微生物對除草劑降解的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，降解菌菌庫也得到不斷的補(bǔ)充，但在實(shí)際應(yīng)用中還面臨許多問題，主要就是這些降解微生物往往易受到復(fù)雜環(huán)境條件的影響[24]，如pH和土壤中有機(jī)質(zhì)含量。有研究表明，盡管在不同 pH 的熟化土壤中咪唑乙煙酸保持相似的含量，但低pH條件下被土壤吸附的咪唑乙煙酸很快釋放, 而高pH條件下土壤吸附的咪唑乙煙酸難以快速解吸附[25]。本研究從溫度、pH和接菌量三個(gè)方面對菌株MZ-1降解條件進(jìn)行優(yōu)化，探究其在不同條件下的降解能力。結(jié)果表明pH對咪唑乙煙酸降解效率的影響最大，且最優(yōu)條件下的pH為6.6，呈弱酸性。因此，菌株MZ-1在實(shí)際應(yīng)用中可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境pH呈弱酸性，保持菌株的降解條件在較優(yōu)水平，使咪唑乙煙酸更易釋放，從而進(jìn)一步提高降解效率。

本研究對降解菌MZ-1的分類學(xué)地位，降解特性進(jìn)行了初步研究，對其降解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并以油菜種子根生長抑制率為標(biāo)準(zhǔn)，對其去毒效應(yīng)進(jìn)行了評價(jià)。但有關(guān)該菌株的代謝途徑，降解產(chǎn)物的成分以及其有關(guān)降解基因的克隆和降解酶制劑等相關(guān)方面還有待進(jìn)一步深入研究。