紅肉和白肉蘋果非濃縮還原汁制汁殘余果渣發(fā)酵產(chǎn)物的分析

王彥博，陳雨，高強，張玉剛，孫曉紅,

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室,山東青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

蘋果(Malus×domesticaBorkh)是薔薇科蘋果屬植物。我國是世界蘋果第一生產(chǎn)大國，其栽培面積和產(chǎn)量在世界上名列前茅，其中用于加工部分的蘋果占10%～20%[1]，蘋果加工產(chǎn)品主要包括濃縮汁、鮮榨汁、蘋果酒[2-3]、蘋果醋[4]、蘋果脆片[5]等。相比于鮮食蘋果，蘋果加工產(chǎn)品尤其是蘋果果汁產(chǎn)品，因其健康營養(yǎng)、方便快捷，受到越來越多消費者的青睞。目前市面上的果汁主要分為濃縮還原(from concentrate，F(xiàn)C)果汁和非濃縮還原(not from concentrate，NFC)果汁，NFC果汁由水果直接壓榨消毒殺菌后灌裝[6]，更多保留了水果本身的口味和營養(yǎng)成分，深受年輕消費群體喜愛。但蘋果制汁后的副產(chǎn)品——蘋果果渣，由于其附加值低，經(jīng)常被廢棄，既污染環(huán)境又浪費資源。

水果發(fā)酵是以水果為原材料，在多種有益微生物的作用下完成。發(fā)酵產(chǎn)物既保留了水果本身的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，又因為經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用而富含酶和多種次生代謝產(chǎn)物，具有較好的抗氧化功能[7]，有益于身體健康[8]。果蔬發(fā)酵產(chǎn)品在日韓和東南亞地區(qū)較為流行，近年來進入我國市場也廣受歡迎。姜峰等[9]以青梅為材料進行發(fā)酵，測得發(fā)酵產(chǎn)物有著良好的抗氧化能力；王虹玲等[10]以軟棗獼猴桃、寒富蘋果和百香果為原料進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力和清除自由基能力顯著；邵穎等[11]以48種水果蔬菜發(fā)酵制作發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中多種酶尤其是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性都有所提高；劉曉燕等[12]使用刺梨果渣發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中各種有機酸的含量都有所提高。但是以蘋果果渣、尤其是紅肉蘋果果渣為原料進行發(fā)酵的研究鮮有報道。

本研究利用NFC制汁殘余果渣生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，測定紅肉蘋果果渣和白肉蘋果果渣在7個發(fā)酵時間的營養(yǎng)成分和抗氧化能力，以期為蘋果果渣發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)利用和提高NFC果汁的附加值提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

紅肉蘋果(‘2011-W21-2Z-N7-W’和‘2011-W25-1Z-N4-N’)和白肉蘋果(‘福麗’和‘富士’)加工NFC果汁剩余的果渣，紅糖(青州市康嘉食品有限公司)，雙歧桿菌酸奶發(fā)酵粉(北京川秀科技有限公司)。

1.1.2 試驗藥品

超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；考馬斯亮藍試劑為實驗室配制；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)有限公司；硫酸亞鐵購自中國天津市巴斯夫化工有限公司；水楊酸購自國藥集團化學(xué)有限公司；乙醇與甲醇購自天津市富宇精細化工有限公司；磷酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水為實驗室自制。

1.1.3 試驗儀器

酶標(biāo)儀(Bio Tek Cytation1)，高效液相色譜HPLC(Agilent1260)，自動高壓蒸汽滅菌鍋(GI80TW)，離心機(TGL-16G)，超聲波清洗機(KQ3200E)，超凈工作臺(SW-CJ-1FD)，水浴鍋，移液槍，天平等。

1.2 試驗方法

1.2.1 果渣發(fā)酵

(1) 發(fā)酵所用錐形瓶、蒸餾水、鑷子等用高壓蒸汽滅菌器滅菌，移液槍和天平用75%乙醇擦拭，紅糖、果渣在超凈工作臺上平鋪，紫外殺菌0.5 h，后期所有操作均在超凈工作臺中進行。

(2) 雙歧桿菌發(fā)酵粉1 g溶于50 mL蒸餾水制成發(fā)酵菌液。

(3) 每份稱量20 g果渣、15 g紅糖、40 mL蒸餾水，放入錐形瓶，超聲處理30 min，向發(fā)酵瓶中加入1 mL菌液，密封。

(4) 將錐形瓶擺放于培養(yǎng)箱，25 ℃避光發(fā)酵0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d和60 d，共7個處理，分別記為1、2、3、4、5、6、7。

1.2.2 發(fā)酵液制備

(1) 將發(fā)酵完畢的錐形瓶置于超聲儀中在4 ℃以下超聲處理30 min，充分釋放發(fā)酵產(chǎn)物。

(2) 發(fā)酵內(nèi)容物分裝在50 mL離心管中，4 ℃，5 000 r/min離心30 min。

(3) 離心上清液即為待測樣品，分裝在2 mL的離心管中，標(biāo)注日期和處理批次，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pH測定

用pH儀測定樣品的pH。

1.2.4 有機酸測定

1.2.4.1 蘋果酸測定

按照一定濃度梯度，配制蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)樣液，用一次性針管過濾器抽濾，備用。有機相(甲醇)和水相(千分之一磷酸)用抽濾漏斗抽濾后放入超聲破碎儀中超聲振出氣泡。用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析標(biāo)準(zhǔn)樣品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品用一次性針管過濾器抽濾，用HPLC分析樣品蘋果酸含量。

1.2.4.2 草酸測定

按照一定濃度梯度，配制草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，用一次性針管過濾器抽濾，備用。草酸測定方法同蘋果酸。

1.2.5 總蛋白質(zhì)含量測定

用考馬斯亮藍G-250法測定樣品總蛋白質(zhì)含量[13]，用1 mg/mL的牛血清白蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程來計算樣品蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 抗氧化能力測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率測定

利用DPPH檢測法檢測樣品中DPPH自由基清除能力，方法如下：在66 μL的樣品溶液中加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基醇溶液(0.078 8 g 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基溶于1 L乙醇中)132 μL。充分混勻后立即使用酶標(biāo)儀在515 nm處測量吸光度記為A0，避光反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀在515 nm處測量吸光度記為A30。用純乙醇做空白。

計算公式：

DPPH清除率(%)=(A0-A30)/A0×100%

A0為反應(yīng)開始時的吸光度；A30為反應(yīng)30 min后的吸光度。

1.2.6.2 HO·清除率測定

在96孔板中加入50 μL樣品，50 μL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液(1.368 g/L，即用136.8 mg硫酸亞鐵溶于100 mL蒸餾水中)，50 μL濃度為9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液(1.243 g/L，即用124.3 mg水楊酸溶于100 mL無水乙醇中)，最后加入50 μL濃度為8.8 mmol/L的H2O2啟動反應(yīng)。本底測定用50 μL蒸餾水代替H2O2，其余試劑與樣品測定相同。200 μL蒸餾水滴入96孔板做空白對照，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后測定510 nm下樣品的吸光度值。

公式如下：

HO·清除率(%)=[Ao-(Ax-Axo)/Ao]×100%

Ao為空白對照吸光度；Ax為樣品吸光度；Axo為本底吸光度。

1.2.7 SOD活性檢測

SOD活性檢測參照超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司)說明書操作。

X為抑制百分率(%)；A01為空白組1的吸光度；A02為空白組2的吸光度；AX為樣品組吸光度；F為樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

紅肉果渣和白肉果渣各設(shè)置7個發(fā)酵時間分組處理，每組3個重復(fù)；每個樣品測定3次，技術(shù)重復(fù)結(jié)果取平均值。利用Excel軟件和GraphPad Prism軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物的pH與有機酸分析

發(fā)酵過程中有機酸的含量影響pH的大小，反映了發(fā)酵的進程。紅肉和白肉蘋果果渣不同發(fā)酵時間的蘋果酸和草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量見圖1、圖2。從圖1和圖2中我們可以看出，發(fā)酵過程開始時(處理1)，由于紅肉果渣含有更多的蘋果酸和草酸，其含量分別達到1.860 mg/mL和0.170 mg/mL；而白肉果渣蘋果酸和草酸的含量只有0.590 mg/mL和0.046 mg/mL。紅肉和白肉蘋果果渣不同發(fā)酵時間的pH見圖3。結(jié)合圖1、圖2發(fā)現(xiàn)，處理1(0 d)紅肉果渣和白肉果渣pH相差很大，是由紅肉果渣和白肉果渣中蘋果酸和草酸含量差距造成。隨著發(fā)酵的進行，紅肉果渣的蘋果酸在處理3(20 d)時出現(xiàn)了短暫的下降之后又出現(xiàn)了回升，并且30 d時基本穩(wěn)定在2.600 mg/mL，后續(xù)發(fā)酵過程變化不大；而白肉果渣的蘋果酸含量先上升，30 d時達到頂峰，含量為1.670 mg/mL，隨后下降。紅肉果渣和白肉果渣的草酸含量隨著發(fā)酵的進行，都呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。

圖1 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)及紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物蘋果酸含量(B)Fig. 1 Standard curves of malic acid (A) and malic acid content of red-fleshed apple andwhite-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：橫坐標(biāo)1、2、3、4、5、6、7分別表示處理0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d和60 d，下同；“**”表示P<0.05。

圖2 草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)及紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物的草酸含量(B)Fig. 2 Standard curves of oxalic acid (A) and oxalic acid content of red-fleshed apple andwhite-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：ns表示無顯著差異P>0.1。

圖3 紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物的pHFig. 3 pH values of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注： ns表示無顯著差異P>0.1；“**”表示P<0.05。

在發(fā)酵過程中，紅肉果渣蘋果酸的含量始終高于白肉果渣。發(fā)酵20 d、30 d和50 d時紅肉果渣草酸的含量低于白肉果渣。因為在發(fā)酵果渣中蘋果酸的含量遠高于草酸的含量，所以總體比較紅肉果渣的有機酸含量高于白肉果渣，表現(xiàn)為紅肉果渣的pH基本低于白肉果渣的pH。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量分析

紅肉和白肉蘋果果渣在不同發(fā)酵時間的蛋白質(zhì)含量見圖4。通過比較發(fā)現(xiàn)，不論紅肉果渣還是白肉果渣，發(fā)酵過程中其蛋白質(zhì)的含量均有所下降，沒有顯著變化。相同處理組紅肉果渣的蛋白質(zhì)含量始終高于白肉果渣，兩者差異顯著。

圖4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)及紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量(B)Fig. 4 Standard curves of protein (A) and protein content of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：顯著性差異“***”表示P<0.01。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力分析

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色。當(dāng)加入自由基清除劑后其顏色變淺，吸光度變小，且與自由基清除率呈線性關(guān)系，因此被廣泛應(yīng)用于抗氧化能力的測定。羥基自由基對自由基反應(yīng)較強，也常用于抗氧化能力的測定。

紅肉和白肉蘋果果渣不同發(fā)酵時間發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力測定見圖5、圖6。從圖5看出紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物DPPH清除率在處理4(30 d)顯著高于處理1、2、3，達到58.41%，之后略微提高。白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物DPPH清除率，處理1、2、3均高于同處理的紅肉果渣，處理4(30 d)清除率升高到56.32%，低于同處理的紅肉果渣。紅肉和白肉蘋果果渣的DPPH清除率均在30 d達到較高水平，紅肉果渣清除率略高于白肉果渣，但差異不顯著。

圖5 紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物DPPH清除能力測定Fig. 5 Determination of DPPH scavenging ability of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示無顯著差異 P>0.1。

從圖6可以看出整個發(fā)酵過程中紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物的羥基自由基清除率始終高于白肉果渣。紅肉果渣羥基自由基清除率在35.25%上下浮動，不同處理差異不顯著(P>0.1)。而白肉果渣的羥基自由基清除率，隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，并且從處理5(40 d)后大幅降低，顯著低于紅肉果渣。

圖6 紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物羥基自由基清除能力測定Fig. 6 Determination of hydroxyl radical scavenging ability of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示無顯著差異P>0.1；“**”表示P<0.05。

綜合分析，紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物羥基自由基清除能力高于白肉果渣，而DPPH清除能力與白肉果渣無顯著差異。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力分析

紅肉和白肉蘋果果渣不同發(fā)酵時間的SOD活力測定結(jié)果見圖7。圖中可以看出紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物SOD活力呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，在處理5(40 d)酶活力最高，達到了132.66 U/g。白肉果渣發(fā)酵在處理6(50 d)時SOD活力達到最高值，為150.58 U/g。綜合比較紅肉果渣和白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力，在處理4、5時期紅肉果渣SOD活力顯著高于白肉果渣(P>0.1)，處理6時期白肉果渣SOD活力顯著高于紅肉果渣(P>0.1)，其他處理兩者無顯著差異。

圖7 紅肉和白肉蘋果果渣不同處理發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力比較Fig. 7 Comparison of SOD activity of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示無顯著差異P>0.1；“*”表示P<0.1。

3 討論

本研究使用NFC制汁殘余的紅肉和白肉蘋果果渣進行發(fā)酵，檢測了7個發(fā)酵處理發(fā)酵產(chǎn)物的pH、特征有機酸和蛋白質(zhì)含量、抗氧化能力及SOD酶活力，比較紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物與白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物的差異。

發(fā)酵過程中，特征有機酸表示微生物代謝的情況，而pH的變化表示發(fā)酵的進程并與特征有機酸相關(guān)。蘋果果渣中主要的特征有機酸為蘋果酸和草酸。我們比較紅肉、白肉果渣的pH和特征有機酸，發(fā)現(xiàn)30 d左右發(fā)酵基本進入了穩(wěn)定狀態(tài)，后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)物的酸度并沒有明顯的變化，紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物在酸度上高于白肉果渣。陳小偉等[14]使用草莓進行發(fā)酵時還測量了發(fā)酵產(chǎn)物的總酸和總糖，更能反映發(fā)酵進程的變化。

蛋白質(zhì)是發(fā)酵產(chǎn)物中重要的營養(yǎng)成分[15-16]。比較紅肉與白肉果渣發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)明顯高于白肉果渣。并且整個發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的含量變化不顯著，保持相對穩(wěn)定。今后在蛋白質(zhì)營養(yǎng)方面會加強相關(guān)酶和氨基酸的研究，更進一步探究其營養(yǎng)成分的變化。

當(dāng)前很多疾病都是自由基過氧化導(dǎo)致的，發(fā)酵產(chǎn)物作為一種生物大分子，能參與人體代謝[17]，減緩自由基氧化[18-20]。近年來發(fā)酵產(chǎn)物的研發(fā)備受關(guān)注，本研究通過對DPPH清除率和羥基自由基清除率的測定，發(fā)現(xiàn)紅肉和白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH清除率均提高，但二者差異不顯著，紅肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物羥基自由基清除率優(yōu)于白肉果渣。超氧化物歧化酶是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，它廣泛存在于生物體中[21]并對有機體氧化和抗氧化的平衡起著至關(guān)重要的作用[22-23]，超氧化物歧化酶協(xié)同過氧化氫酶和過氧化物酶能夠把有害的超氧自由基降解。本研究發(fā)現(xiàn)果渣發(fā)酵提高了SOD活力，紅肉果渣在發(fā)酵40 d SOD活力最高，且顯著高于白肉果渣，而白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物SOD活力在50 d后達到最高值。

綜上所述，NFC制汁殘余果渣是優(yōu)質(zhì)發(fā)酵原料，紅肉蘋果果渣發(fā)酵產(chǎn)物在有機酸、蛋白質(zhì)、羥基自由基清除率方面優(yōu)于白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物，在SOD活力和DPPH清除率方面與白肉果渣發(fā)酵產(chǎn)物無明顯差異。綜合測評，紅肉蘋果果渣發(fā)酵40 d以上效果最佳。