王暉，郭霄，馬翔，李明燕，柳健，李有，孫迎坤，郝青，李偉，劉慶超，劉慶華，王奎玲

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東青島 266109；2.濟(jì)南市林場(chǎng)，山東濟(jì)南 250100)

酸雨是指pH小于5.6的降水[1]。近年來，由于化石燃料的燃燒，釋放出大量的二氧化硫和氮氧化合物，在大氣中形成酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)隨雨雪降落到地面或植物體上，形成酸雨。目前我國(guó)已成為世界三大酸雨集中地之一。酸雨主要分布在我國(guó)東部平原、東南沿海和西南四川盆地，各地區(qū)因氣候和環(huán)境存在差異，酸雨的pH和頻率也有所不同[2]。對(duì)2003—2018年間全國(guó)291個(gè)城市的持續(xù)降水監(jiān)測(cè)研究結(jié)果表明：全國(guó)降水酸度明顯降低,其中,2003—2006 年降水酸度有所升高,而2006年之后則呈降低趨勢(shì)；我國(guó)降水中的硝酸根與硫酸根離子物質(zhì)的量比總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，酸雨類型正由硫酸型轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩?、硝酸混合型[3]。

酸雨對(duì)植物的個(gè)體乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響[4-5]。酸雨會(huì)腐蝕植物體的外表保護(hù)層，改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而侵入植物體內(nèi)，破壞組織和器官，影響生理代謝功能，導(dǎo)致植物體發(fā)育不良[6]。主要表現(xiàn)為葉綠素含量降低、葉萎縮和畸形、光合作用受阻、生物量減少，甚至植物枯萎死亡[7-8]。目前，我國(guó)的酸雨范圍明顯擴(kuò)大，資料顯示我國(guó)北方地區(qū)酸雨污染形勢(shì)明顯加重[9]，因此研究酸雨對(duì)北方樹種的影響具有重要的意義。

耐冬山茶[Camelliajaponica(NaiDong)]，山茶科，山茶屬，常綠闊葉灌木或小喬木，是分布于膠東半島地區(qū)的一個(gè)山茶原生種群，是世界上分布最北的山茶種群，耐低溫性強(qiáng)，花期長(zhǎng)，冬季開花，故當(dāng)?shù)胤Q之為“耐冬”山茶[10]。資料顯示，由于自然生境的改變、棲息地的破壞及人為干擾，大量耐冬山茶野生種群逐步減少，目前只剩500余株(叢)，分別存在于長(zhǎng)門巖島、大管島及嶗山頂三處[11]。耐冬山茶作為北方地區(qū)原有的常綠闊葉樹種，具有獨(dú)特的遺傳特性和重要的觀賞價(jià)值，是北方地區(qū)僅有的常綠冬季開花植物，其栽培范圍的擴(kuò)大對(duì)于豐富北方園林冬季景觀具有重要意義。

面對(duì)酸沉降日益加劇的環(huán)境，耐冬山茶幼苗對(duì)酸雨的響應(yīng)機(jī)制尚不明確，且目前對(duì)植物生長(zhǎng)影響的研究主要集中在酸雨酸度(即酸雨pH)上，關(guān)于酸雨酸度和酸沉降頻率雙因素對(duì)植物的生長(zhǎng)影響研究較少。因此，本文通過溫室控制試驗(yàn)?zāi)M不同的酸雨酸度和酸沉降頻率研究酸雨對(duì)耐冬山茶幼苗的生理生態(tài)學(xué)影響，為未來酸沉降環(huán)境下耐冬山茶資源的保護(hù)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為1年生耐冬山茶實(shí)生苗。2018年9月在青島市植物園收集耐冬山茶種子，12月采用沙藏的方法對(duì)種子進(jìn)行催芽，3月初將露白的種子種植到花盆(高15 cm、直徑15 cm)中。栽培基質(zhì)為草炭和園土體積比為1∶1的混合基質(zhì)，6月初，篩選長(zhǎng)勢(shì)一致的耐冬山茶幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年夏季在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)采用全因子設(shè)計(jì)方法，設(shè)置3個(gè)模擬酸雨pH水平和3個(gè)添加頻率水平。3個(gè)模擬酸雨pH分別是對(duì)照組(pH5.6)、輕度酸雨脅迫(pH4.0)和重度酸雨脅迫(pH3.0)；3個(gè)添加頻率: 每6 d一次為高添加頻率、每12 d一次為中添加頻率、每18 d一次為低添加頻率，編號(hào)分別為F1、F2、F3。我國(guó)主要是以硫酸根型酸雨為主，試驗(yàn)選用硫酸、硝酸和氯化鈣配置模擬酸雨母液，其中硫酸根離子、硝酸根離子和氯離子物質(zhì)的量比為5∶1∶0.8，然后使用pHS-2C酸度計(jì)將模擬酸雨母液分別標(biāo)定稀釋成pH為3.0、4.0的溶液，稀釋溶劑為蒸餾水，以pH5.6自來水作為對(duì)照(CK)。模擬酸雨噴灑采用小型噴霧器噴霧法，于2019年6月中旬開始噴灑，分別用pH3.0、4.0、5.6的模擬酸雨對(duì)各組植株進(jìn)行脅迫處理，分別每6 d、12 d、18 d噴灑一次，每次噴灑以葉片滴液為標(biāo)準(zhǔn)，噴淋在16：00—18：00進(jìn)行。本試驗(yàn)共9個(gè)處理組，每組7個(gè)重復(fù)，共處理63盆，試驗(yàn)處理時(shí)間共計(jì)108 d。整個(gè)試驗(yàn)過程中，采用自然光照，保證溫室內(nèi)通風(fēng)良好，及時(shí)進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)管理工作，防止夏季經(jīng)常出現(xiàn)的多風(fēng)多雨天氣的影響，定時(shí)除雜草、捉蟲等。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

在最后一次添加模擬酸雨溶液的7 d后，用精度為0.01 cm的游標(biāo)卡尺測(cè)量基徑，用精度為0.1 cm的直尺測(cè)量耐冬山茶幼苗的株高、冠面積。冠面積的計(jì)算采用Li等[12]的公式：

冠面積Scrown=0.25πab

其中：a為每株幼苗最大伸展處測(cè)量所得冠幅長(zhǎng)，cm；b為在其平面垂直方向測(cè)量所得冠幅寬，cm。

摘取植株完全展開的健康成熟葉片，用電子天平稱量每個(gè)葉片的鮮重(MLFW)并記錄，然后用便攜式葉面積儀(Yaxin-1241，北京雅欣理儀科技有限公司)測(cè)量葉片面積(SLA)并記錄。最后將葉片放入烘箱中用85 ℃烘48 h使其完全脫水后稱量其干重(MLDW)。根據(jù)公式計(jì)算比葉面積(SLA)和葉片含水量(LWC)：

SLA=SLA/MLDM×100%

LWC= (MLFM-MLDM)/MLFM×100%

1.3.2 氣體交換參數(shù)的測(cè)定

使用便攜式CIRAS-3光合儀(PP SYSTEMS公司，美國(guó))對(duì)植株從上往下的第2～3片葉進(jìn)行氣體交換參數(shù)的測(cè)定，有凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(E)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、細(xì)胞間隙二氧化碳濃度(Ci)等參數(shù)。測(cè)量時(shí)的參數(shù)設(shè)置為光強(qiáng) 1 000 μmol·m-2·s-1，葉室溫度 27 ℃， 濕度為 60%，CO2濃度為 400 μmol·mol-1。每個(gè)處理測(cè)定7個(gè)重復(fù)。根據(jù)公式計(jì)算氣孔限制值(Ls)：

Ls=1-Ci/Ca，其中Ca為空氣CO2濃度。

1.3.3 葉綠素含量的測(cè)定

用乙醇提取法和分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素95%乙醇提取液在665 nm和649 nm處的吸光度D665和D649，并根據(jù)公式計(jì)算相關(guān)的葉綠素含量：

Ca=13.95D665-6.88D649；

Cb=24.96D649-7.32D665；

葉綠體色素的含量CChl=(C×V)/Mch1;

總?cè)~綠素含量：CT=Ca+Cb;

葉綠素a/b(Chl a/b )=Ca/Cb;

其中：C為色素濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；Ca為葉綠素a含量，mg·g-1；Cb為葉綠素b含量，mg·g-1；Mch1為樣品干重，g。

1.3.4 植株生物量指標(biāo)的測(cè)定

以上參數(shù)全部測(cè)量完畢后，將試驗(yàn)所用的全部的63棵耐冬山茶幼苗整株挖出，切割分解為根、莖、葉三部分，分別放入烘箱中80 ℃ 烘48 h，最后使用電子天平稱量根、莖、葉干重并計(jì)算總生物量、根生物量比、葉生物量比及根冠比。

總生物量MTB=MRB+MSB+MLB；

根生物量比(RMR)=MRB/MTB；

葉生物量比(LMR)=MLB/MTB；

根冠比(RS)=MRB/ (MLB+MSB)

其中：MRB為根生物量，MLB為葉生物量，MSB為莖生物量，MTB為總生物量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel2019錄入數(shù)據(jù)，釆用SPSS21對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素和雙因素的ANOVA分析，比較各個(gè)參數(shù)分別在酸沉降和不同添加頻率下的差異，以及兩因素間是否存在交互作用。存在顯著差異之后進(jìn)行鄧肯(Duncan)多重比較(α=0.05)，并用字母進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)、葉形態(tài)特征、氣體交換參數(shù)、葉綠素含量及生物量進(jìn)行雙因素方差分析與研究，所得結(jié)果如下：

2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)不同模擬酸雨的響應(yīng)

模擬酸雨pH值、添加頻率及二者交互作用對(duì)耐冬山茶株高和基徑的影響不顯著，冠面積受添加頻率的影響極顯著(表1)，在不同pH下均在中添加頻率時(shí)達(dá)到最大值。如圖1所示，在pH4.0時(shí)，隨著添加頻率的下降，耐冬山茶幼苗的基徑先減少后增大(圖1B)，而在pH5.6和pH3.0時(shí)，基徑先增大后減少，但差異不顯著。

表1 耐冬山茶幼苗生理生態(tài)指標(biāo)的雙因素方差分析(以酸度和頻率作為固定因子)Table 1 Results of two-way analysis of variance (ANOVA) for Camellia japonica (Naidong)seedlings on ecophysiological parameters, with acidity and frequency of acid deposition as fixed factors

續(xù)表

圖1 不同的酸度和酸沉降添加頻率對(duì)耐冬山茶幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Fig. 1 Effects of different acidities and frequencies of acid deposition on growth parameters of C. japonica (NaiDong) seedlings注：不同小寫字母表示不同處理間在P≤0.05水平差異顯著，下同。

2.2 生物量對(duì)不同模擬酸雨的響應(yīng)

耐冬山茶的生物量受模擬酸雨pH、添加頻率及兩者的交互作用的影響不顯著(表1)。如圖2A所示，在模擬酸雨pH3.0時(shí)，高添加頻率下根生物量最大，這說明高頻率的重度模擬酸雨脅迫使耐冬山茶幼苗增加了地下部分的生長(zhǎng)。莖生物量、葉生物量和總生物量的變化不顯著(圖2B、2C、2D)。

圖2 不同的酸度和酸沉降添加頻率對(duì)耐冬山茶幼苗生物量的影響Fig. 2 Effects of different acidities and frequencies of acid deposition on biomass parameters of C. japonica (NaiDong) seedlings

2.3 葉形態(tài)特征對(duì)不同模擬酸雨的響應(yīng)

葉片含水量不受模擬酸雨pH、添加頻率及兩者交互作用的影響，而比葉面積則受到模擬酸雨pH和添加頻率的影響，二者的交互作用對(duì)其無影響(表1，圖3A、3B)。

由圖3A可知，在同一pH值的模擬酸雨下，耐冬山茶比葉面積隨著添加頻率的降低先升高后下降，但差異并不顯著。在添加頻率為F2時(shí)比葉面積達(dá)到最大值，在pH5.6、pH4.0及pH3.0條件下分別為120.7、105.32、124.3 cm2·g-1。 總體看，隨著酸雨pH的降低及模擬酸雨施加頻率的降低，比葉面積增大。

圖3 不同的酸度和酸沉降添加頻率對(duì)耐冬山茶幼苗葉形態(tài)特征的影響Fig. 3 Effects of acidities and frequencies of acid deposition on leaf morphological traits of C. japonica (NaiDong) seedlings

2.4 葉綠素含量對(duì)不同模擬酸雨的響應(yīng)

耐冬山茶葉片的總?cè)~綠素含量受模擬酸雨pH和添加頻率二者交互作用的影響顯著(表1)。由圖4A可知，在高添加頻率條件下， pH4.0和pH3.0處理下的總?cè)~綠素含量與對(duì)照比分別提高了36.04%和132.92%；在中頻添加處理下，總?cè)~綠素含量隨酸度增加則呈下降趨勢(shì)，pH4.0和pH3.0處理下與對(duì)照比分別下降了42.96%和52.34%；低添加頻率的處理下葉綠素總量不受模擬酸雨pH改變的影響，這說明，耐冬山茶幼苗對(duì)低頻率的模擬酸雨有一定的抵抗作用。葉綠素a/b未受模擬酸雨pH影響(表1，圖4B)。

圖4 不同酸度和酸沉降添加頻率對(duì)耐冬山茶幼苗葉綠素含量的影響Fig. 4 Effects of acidities and frequencies of acid deposition on chlorophyll content of C. japonica (NaiDong) seedlings

2.5 氣體交換參數(shù)對(duì)不同模擬酸雨的響應(yīng)

耐冬山茶的氣體交換參數(shù)不受添加頻率和兩者交互作用的影響，凈光合速率(Pn)、細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)和氣孔限制值等參數(shù)受模擬酸雨pH影響顯著，蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度受模擬酸雨影響不顯著(表1)?？傮w看，隨著模擬酸雨pH的降低，凈光合速率、氣孔限制值降低，細(xì)胞間隙CO2濃度呈增加趨勢(shì)(表1，圖5A、5C、5D)。在同一添加頻率下，隨著模擬酸雨的pH值降低，耐冬山茶幼苗的凈光合速率呈下降趨勢(shì)，且pH3.0的處理低于其余兩組，但不顯著。在F1和F2添加頻率下，Ci隨著模擬酸雨pH的降低而增加，但增加并未達(dá)到顯著水平，F(xiàn)2添加頻率處理的葉片Ci在pH3.0模擬酸雨的脅迫下相較于pH5.6和pH4.0分別提升了177.67%和74.84%。在高、中添加頻率處理下，隨著模擬酸雨pH的降低，氣孔限制值逐漸降低，而在低添加頻率處理下，氣孔限制值不受模擬酸雨pH的影響。

圖5 不同的酸度和酸沉降添加頻率對(duì)耐冬山茶幼苗氣體交換參數(shù)的影響Fig. 5 Effects of acidities and frequencies of acid deposition on gas exchange parameters of C. japonica (NaiDong) seedlings

3 討論

酸雨對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著極大的影響[13]，不同pH的酸雨對(duì)植物的影響是不同的，而酸沉降頻率的差異會(huì)導(dǎo)致酸雨對(duì)植物的脅迫時(shí)間不同，也會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生影響[14]。

酸雨對(duì)植物造成傷害的程度受植物種類和接觸時(shí)間的影響，最重要的因素是酸雨的pH值。有研究表明，酸雨對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)在對(duì)葉片的直接傷害[15]，酸雨有強(qiáng)烈的腐蝕性，隨著酸雨pH的降低及脅迫時(shí)間延長(zhǎng)以至超過了植物的耐受限度時(shí)，植物葉片表層結(jié)構(gòu)上的蠟質(zhì)和角質(zhì)層將會(huì)受到破壞，保護(hù)組織的正常功能失效，進(jìn)而大量的酸性物質(zhì)就會(huì)通過表皮和氣孔進(jìn)入到植物葉片細(xì)胞內(nèi)，使植物細(xì)胞中毒，植物正常的生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育都會(huì)因此受到干擾[16]。本研究中，耐冬山茶總生物量不受模擬酸雨酸度、施加頻率及二者交互作用的影響，說明耐冬山茶對(duì)短期模擬酸雨脅迫具有較強(qiáng)抗性與忍耐力。從耐冬山茶葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)看，耐冬山茶葉片革質(zhì)、表面光滑，且在外層有著較為厚實(shí)的蠟質(zhì)層和角質(zhì)層，酸雨無法在葉片上長(zhǎng)時(shí)間滯留，酸雨對(duì)耐冬山茶的影響就會(huì)降低，因此模擬酸雨未對(duì)耐冬山茶總生物量造成顯著影響。

雙因素方差分析結(jié)果表明，添加頻率顯著影響了耐冬山茶的冠面積。隨著添加頻率的降低，耐冬山茶幼苗的冠面積先上升后下降，表明添加頻率對(duì)耐冬山茶的影響存在一定的閾值?？赡茉谳^高的添加頻率下，植株頻繁接觸酸雨，使植株的脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致植株受酸雨脅迫嚴(yán)重[17]，進(jìn)而影響了耐冬山茶正常的生長(zhǎng)發(fā)育。前人多次研究表明，低濃度的酸雨并不會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響，部分植物還會(huì)因低濃度的酸雨而得到促進(jìn)作用，但高濃度的酸雨則會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[18-20]。本研究中，在同一模擬酸雨pH下，間隔較長(zhǎng)時(shí)間的低添加頻率條件下耐冬山茶幼苗的冠面積相比中等添加頻率有所下降，原因可能是模擬酸雨中含有氮元素、硫元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適當(dāng)頻率的模擬酸雨或許會(huì)增加植株可利用的營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

比葉面積指的是葉的單位面積與其干物質(zhì)質(zhì)量的比值，是反映葉片厚度與植物生長(zhǎng)速率的重要參數(shù)，受環(huán)境因素變化的影響。本研究中，模擬酸雨酸度增加了比葉面積，說明更高的模擬酸雨酸度，加速了對(duì)葉片表面的腐蝕作用，使葉片變?。皇┘宇l率降低了比葉面積，其原因可能是頻繁酸沉降條件下，耐冬山茶增加了向葉片細(xì)胞壁的投入，使葉片增厚以抵抗酸雨。

植物光合器官的功能與膜系統(tǒng)息息相關(guān)，隨著酸雨pH的降低及脅迫時(shí)間延長(zhǎng)以至超過了植物的耐受限度時(shí)，植物葉片表層結(jié)構(gòu)就會(huì)遭到破壞，進(jìn)而影響植物的細(xì)胞膜。酸雨破壞了植物葉片的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，改變了葉片生理生化特性，葉片中的酶、葉綠素等都會(huì)在酸性物質(zhì)的侵蝕下失效分解，進(jìn)而抑制植物的光合作用[21-23]。在本試驗(yàn)中，在高添加頻率下，隨添加模擬酸雨的pH降低，耐冬山茶葉片的總?cè)~綠素含量相較于對(duì)照組增加，這與王玉魁等[24]對(duì)毛竹的研究結(jié)果相似，這有可能與山茶屬植物自身的生活習(xí)性有關(guān)，山茶屬植物喜酸，微酸的壤土和腐葉土最適合其生長(zhǎng)，同時(shí)酸雨中含有大量的氮元素，促進(jìn)了葉綠素的合成，并且輕度的酸雨對(duì)植物葉片的侵蝕作用不嚴(yán)重，導(dǎo)致了葉綠素的大量積累。

耐冬山茶的凈光合速率隨著模擬酸雨的pH的降低逐漸下降，其細(xì)胞間隙CO2濃度的變化趨勢(shì)與凈光合速率相反，按照Farquhar和Sharkey的理論[25]，這也說明了耐冬山茶凈光合速率的降低是非氣孔限制型。

酸雨與添加頻率的交互作用對(duì)耐冬山茶的影響并不顯著，僅對(duì)葉綠素含量有影響。我們推測(cè)其可能有兩方面的原因，一方面是耐冬山茶幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，而酸雨對(duì)植物的影響是需要較長(zhǎng)時(shí)間才能顯現(xiàn)的，因此較短時(shí)間的酸雨處理不能對(duì)耐冬山茶幼苗的各項(xiàng)生理活動(dòng)產(chǎn)生較大影響；另一方面，由于山茶屬植物喜歡生長(zhǎng)在偏微酸的環(huán)境當(dāng)中，其對(duì)酸性的環(huán)境有著更高的耐受度，因此在面對(duì)酸雨脅迫時(shí)，短時(shí)間內(nèi)的正常生理活性不會(huì)發(fā)生較大改變，這就使得酸雨和添加頻率的交互作用對(duì)耐冬山茶植株的作用不明顯。在輕度脅迫下，酸雨脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞光合活性有一定的刺激作用，而采用高頻度處理，脅迫次數(shù)增多，對(duì)葉肉細(xì)胞的傷害程度也大[26]。耐冬山茶葉片革質(zhì)，表皮覆蓋較厚蠟質(zhì)層和角質(zhì)層，對(duì)酸雨液滴的滯留時(shí)間較短，其結(jié)構(gòu)形態(tài)特點(diǎn)對(duì)酸雨中有害離子侵入具有抵抗作用，重度酸雨脅迫下也未見明顯傷斑[27]。

4 結(jié)論

模擬酸雨酸度主要影響耐冬山茶幼苗的比葉面積、凈光合速率、細(xì)胞間隙CO2濃度和氣孔限制值；添加頻率影響了冠面積和比葉面積；模擬酸雨酸度和添加頻率的交互作用僅影響總?cè)~綠素含量。耐冬山茶對(duì)短期模擬酸雨脅迫具有較強(qiáng)抗性與忍耐力，其總生物量未受模擬酸雨酸度、施加頻率及二者交互作用的影響。

模擬酸雨對(duì)耐冬山茶幼苗生長(zhǎng)的影響，可為進(jìn)一步開展酸沉降格局對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。