佀勝利 鄒莎莎 吳書云 王成湘

摘 要 從林下腐熟土壤中篩選可降解纖維素的天然微生物，經(jīng)過初篩、復(fù)篩得到降解能力較強(qiáng)的菌株DT13，革蘭氏染色和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis DT13）。以羧甲基纖維素酶活性（Carboxymethyl Cellulase Activity，CMCA）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)對(duì)菌株DT13產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳產(chǎn)酶條件為初始pH值7.0、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間96 h。

關(guān)鍵詞 芽孢桿菌;羧甲基纖維素酶活性;發(fā)酵條件;酶活測(cè)定

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.02.007

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，是自然界中現(xiàn)有數(shù)量最多且最低廉的資源，目前尚未得到充分合理的利用[1]。在自然狀態(tài)下，纖維素的生物降解主要通過微生物分泌的纖維素酶來完成，降解過程無污染、成本低，因而纖維素降解微生物的篩選一直受到研究者的關(guān)注[2-3]。自然界存在的產(chǎn)纖維素酶的微生物種類較多，對(duì)纖維素的降解能力差異較大，通過對(duì)其培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以有效提高產(chǎn)纖維素酶的效率和對(duì)纖維素的降解能力[4-6]。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

多年自然生長(zhǎng)松樹林下充分腐熟的松針土，采集于貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：K2HPO4 1.00 g·L-1、NaCl 0.10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1、NaNO3 2.50 g·L-1、FeCl3 0.001 g·L-1、CaCl2 0.10 g·L-1。培養(yǎng)基按照每瓶50 mL進(jìn)行分裝，每個(gè)三角瓶中放入約0.50 g濾紙條，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 2.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1、K2HPO4 1.00 g·L-1、NaCl 0.50 g·L-1、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.00 g·L-1、瓊脂20.00 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

含剛果紅的篩選培養(yǎng)基：在篩選培養(yǎng)基中加入2.00 g·L-1剛果紅。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3.00 g·L-1、酵母粉0.50 g·L-1、（NH4）2SO4 2.00 g·L-1、KH2PO4 4.00 g·L-1、CaCl2?0.30 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

1.3 纖維素降解菌株的篩選

稱量1.00 g土壤樣品，在30 ℃ 150 r·min-1富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至濾紙條完全裂解。用無菌水連續(xù)稀釋培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)基，得到10-7稀釋液，取稀釋液200 μL均勻涂布到含剛果紅的篩選培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，挑選培養(yǎng)特征不同且具有明顯透明圈的單菌落轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基，純化后冷凍保存。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接篩選培養(yǎng)平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用0.5%的剛果紅溶液染色60 min，再用

1 mol·L-1 NaCl溶液褪色60 min，觀察染色后的透明圈大小。選擇透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃ 150 r·min-1培養(yǎng)72 h，測(cè)定培養(yǎng)液的羧甲基纖維素酶活性（CMCA），選擇CMCA最高的菌株，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.4 纖維素降解菌株的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。接種菌株到篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察菌落培養(yǎng)特征，進(jìn)行革蘭氏染色。

2）分子生物學(xué)鑒定。將培養(yǎng)24 h的純化菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行鑒定，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTT GTTACGACTT-3'）

對(duì)菌株16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收后測(cè)序，利用BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.5 發(fā)酵條件對(duì)纖維素降解菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

1.5.1 單因素試驗(yàn)

選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵初始pH值和發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)篩選出的菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。將篩選出的菌株接種到一定初始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在指定溫度下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，將發(fā)酵液3 000 r·min-1離心10 min，得粗酶液。測(cè)定單因素條件下粗酶液的CMCA確定合適的正交設(shè)計(jì)參數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)組。

1.5.2 正交優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間、初始pH值和發(fā)酵溫度，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，采用L9（33）正交表。

1.6 纖維素酶活性的測(cè)定

纖維素酶活性用DNS法進(jìn)行測(cè)定[6]。在特定條件下，1 mL粗酶液1 min轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1μg還原糖所需的酶量規(guī)定為1個(gè)酶活力單位（U）。取0.50 mL粗纖維素酶溶液、1.00 mL檸檬酸緩沖液（pH=4.8）和1.50 mL CMC-Na溶液充分混勻，50 ℃ 150 r·min-1酶解180 min，之后加入3.00 mL DNS溶液，充分混勻后沸水浴5 min，冷卻后加入3.00 mL蒸餾水，充分混勻后在540 nm處測(cè)定吸光值。同時(shí)，設(shè)置底物空白和酶空白。

1.7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

向干燥試管中分別加入1.00 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.00 mL、0.30 mL、0.60 mL、0.90 mL、1.20 mL、1.50 mL，再分別加蒸餾水至體積為1.50 mL，加入DNS

試劑3.00 mL，混勻，沸水浴5 min后冷卻，最后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后測(cè)定在540 nm的吸光值。以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.290 8x+0.059 4（R2=0.999 1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌株的篩選

將富集液稀釋后涂平板，共分離純化得到12個(gè)產(chǎn)生明顯降解圈的纖維素降解菌株。對(duì)轉(zhuǎn)接后的菌株進(jìn)行剛果紅染色，如圖1所示。通過測(cè)定透明圈直徑（D）

和菌落直徑（d），菌株DT10、DT13、DT14的透明圈直徑比值（D/d）較大。測(cè)定3個(gè)菌株發(fā)酵所得粗酶液的CMCA，如表1所示，DT13的酶活最高，作為進(jìn)一步研究的菌株。

2.2 纖維素降解菌株的鑒定

DT13菌株在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h的菌落呈白色、圓形、濕潤(rùn)無皺褶，如圖1（a）所示。經(jīng)革蘭氏染色后顯微觀察，菌體為細(xì)桿狀，呈紫紅色，為革蘭氏陽性菌，如圖1（b）所示。該菌株經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 434 bp的16S rDNA片段，通過BLAST序列比對(duì)，菌株DT13與枯草芽孢桿菌（B.subtillis）相似度在99.7%以上;選擇相似度較高的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2，DT13與枯草芽孢桿菌的進(jìn)化關(guān)系較近，可靠性較高，確定菌株DT13為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。

2.3 發(fā)酵條件對(duì)菌株DT13產(chǎn)纖維素酶的影響

2.3.1 發(fā)酵條件對(duì)纖維素酶產(chǎn)量影響的單因素試驗(yàn)

將菌株DT13在30 ℃ 150 r·min-1條件下進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵144 h，自發(fā)酵開始每隔24 h取出一次樣品測(cè)定其纖維素酶粗酶液的CMCA。結(jié)果如圖3（a）所示，CMCA隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈增加趨勢(shì)，在96 h時(shí)達(dá)到最高，為4.86 U·mL-1;菌株DT13接種在不同初始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃ 150 r·min-1條件下發(fā)酵96 h，發(fā)酵后粗纖維素酶液的CMCA如圖3（b）所示，CMCA隨著pH值的增加而增大，至pH值7.5時(shí)達(dá)到最大，為5.31 U·mL-1;菌株DT13接種在初始pH值為7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同溫度150 r·min-1條件下發(fā)酵

96 h，發(fā)酵后粗纖維素酶液的CMCA如圖3（c）所示，CMCA隨著溫度的增加而增大，至40 ℃時(shí)達(dá)到最高值，為6.56 U·mL-1，溫度繼續(xù)增加CMCA呈下降的趨勢(shì)。綜合試驗(yàn)結(jié)果，菌株DT13發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的較合適的單因素條件分別為發(fā)酵時(shí)間96 h、初始pH值7.5、發(fā)酵溫度40 ℃。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇A發(fā)酵時(shí)間（84 h、96 h、108 h）、B初始pH值（7.0、7.5、8.0）、C發(fā)酵溫度（37 ℃、40 ℃、43 ℃）設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定各組合得到的粗酶液的CMCA，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。影響發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶CMCA的3個(gè)因素排序?yàn)槌跏紁H值（B）>發(fā)酵溫度（C）>發(fā)酵時(shí)間（A），產(chǎn)酶的最佳組合為A2B1C2。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交極差分析表中，A3B1C2培養(yǎng)組合所產(chǎn)的CMCA值最高，選取A2B1C2、A3B1C2發(fā)酵組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，組合A2B1C2所產(chǎn)生的粗酶液的CMCA約為6.69 U·mL-1，顯著高于組合A3B1C2。因此，確定菌株DT13的最佳培養(yǎng)組合為A2B1C2，即初始pH值7.0、發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時(shí)間96 h。

3 結(jié)論

本研究從森林腐熟土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素降解菌DT13，經(jīng)形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色和分子生物學(xué)鑒定確定DT13為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)菌株DT13發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行研究，確定菌株DT13的最佳發(fā)酵條件為初始pH值7.0、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間96 h。

參考文獻(xiàn)：

[1] 任曉冬，史旭洋，尚鑫，等.木質(zhì)纖維素預(yù)處理研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（5）：567-570.

[2] 王士強(qiáng)，顧春梅，趙海紅.木質(zhì)纖維素生物降解機(jī)理及其降解菌篩選方法研究進(jìn)展[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25（S1）：313-317.

[3] 許從峰，艾士奇，申貴男，等.木質(zhì)纖維素的微生物降解[J].生物工程學(xué)報(bào)，2019，35（11）：2081-2091.

[4] 楊茜，李維尊，鞠美庭，等.微生物降解木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)固廢的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（8）：1569-1583.

[5] 張俊，許超，張宇，等.纖維素酶降解機(jī)理的研究進(jìn)展[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，47（9）：121-130.

[6] 薛藩.纖維素降解微生物的篩選及高效纖維素酶活條件研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2019.

（責(zé)任編輯：劉寧寧）