DNA甲基化通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬影響家蠶翅的發(fā)育

龔程程, 呂 浩, 鄭思春, 徐關(guān)峰

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省昆蟲(chóng)發(fā)育生物與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

DNA甲基化修飾廣泛存在于真核生物中，是表觀遺傳學(xué)重要的調(diào)控形式之一，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶(C)上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)(Adams, 1996)。自Sarkar等于1992年發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)基因組中存在DNA甲基化修飾以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明DNA甲基化普遍存在于昆蟲(chóng)中(Sarkaretal., 1992; Huntetal., 2013)。昆蟲(chóng)基因組DNA甲基化水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物的(約60%～90%)，大多數(shù)昆蟲(chóng)的DNA甲基化水平都小于1%(Bewicketal., 2017)。DNA甲基化在昆蟲(chóng)發(fā)育中的功能主要涉及昆蟲(chóng)繁殖、級(jí)型分化、基因組印跡、翅發(fā)育、性狀分化和抗藥性等(Goll and Bester, 2005; Wangetal., 2013; Xiangetal., 2013; 梁士可等, 2014; Bewicketal., 2019)。然而，昆蟲(chóng)DNA甲基化作用機(jī)制尚需深入的研究。

細(xì)胞自噬(autophagy)，作為細(xì)胞程序性死亡的一種主要形式，其主要功能是去除衰老/受損細(xì)胞，以及降解細(xì)胞內(nèi)多余物來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在動(dòng)植物中，細(xì)胞自噬的發(fā)生往往起始于細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein, Atg)所參與形成的細(xì)胞自噬小體(Griffin, 2005; Orvedahletal., 2010)。細(xì)胞自噬小體的形成經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括起始、成核、延伸和成熟等。起始和成核主要由兩種蛋白復(fù)合體ATG1-ATG13和BECN1/ATG6-PI3K3C來(lái)完成。延伸和成熟主要由兩個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng)ATG12-ATG15和LC3-ATG8-PE來(lái)完成(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)。Light Chain 3(LC3)蛋白是一種公認(rèn)的細(xì)胞自噬標(biāo)記物，主要存在形式為L(zhǎng)C3-I，在細(xì)胞自噬發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3-I蛋白轉(zhuǎn)移到自噬小體內(nèi)，經(jīng)泛素化修飾后形成LC3-II，并定位于成熟的自噬小體的膜上，因此可以通過(guò)熒光標(biāo)記的LC3-II來(lái)識(shí)別自噬小體(Tanidaetal., 2004)。

我們的前期工作通過(guò)利用DNA甲基化抑制劑5-氮-2′脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza-dC)處理家蠶Bombyxmori，證明了DNA甲基化修飾通過(guò)抑制幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，從而保證了翅幾丁質(zhì)含量和翅的正常發(fā)育(Xuetal., 2020)，表明DNA甲基化修飾在翅的發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。然而，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能是通過(guò)多種途徑來(lái)調(diào)控翅的發(fā)育。為此，本研究將進(jìn)一步探討DNA甲基化修飾是否通過(guò)抑制細(xì)胞自噬以保證翅發(fā)育的可能性。5-aza-dC作為一種DNA甲基化的特異性抑制劑，已被證明可以有效降低生物體內(nèi)的DNA甲基化水平(Dastjerdietal., 2014; Cooketal., 2019)。本研究中對(duì)家蠶預(yù)蛹和卵巢Bm12細(xì)胞分別進(jìn)行5-aza-dC和細(xì)胞自噬激活劑SMER28的處理以及細(xì)胞自噬抑制劑Spautin-1的挽救注射，觀察與測(cè)定家蠶Bm12細(xì)胞和翅細(xì)胞的自噬水平以及成蟲(chóng)翅的表型，從而分析DNA甲基化對(duì)細(xì)胞自噬和家蠶翅發(fā)育的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)所用的家蠶品種為大造，蠶卵由廣東省蠶業(yè)研究所提供。幼蟲(chóng)在溫度26.5±0.5℃、相對(duì)濕度70%和光周期14L∶10D的人工氣候箱中飼養(yǎng)。新鮮桑葉采摘自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶學(xué)桑園實(shí)習(xí)基地。

家蠶卵巢Bm12細(xì)胞株來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院。細(xì)胞置于含10%胎牛血清的昆蟲(chóng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶，于27～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3～4 d按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2 5-aza-dC處理家蠶細(xì)胞

為了證明DNA甲基化抑制劑5-aza-dC能夠有效抑制家蠶細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化水平，我們用5-aza-dC處理家蠶卵巢Bm12細(xì)胞。將1 mg 5-aza-dC(Sigma, California, 美國(guó))溶于ddH2O中，配制成濃度為10 μg/μL的母液。將現(xiàn)配制的母液稀釋10倍至終濃度為1 μg/μL。家蠶卵巢Bm12細(xì)胞以合適的密度在12孔板上鋪板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右，將1 μg 5-aza-dC加入到12孔板的每孔家蠶卵巢Bm12細(xì)胞中。

按照DNA抽提說(shuō)明書(shū)分別提取上述5-aza-dC處理12, 24和48 h的Bm12細(xì)胞的總DNA，并用RNase A(Promega, Madison, 美國(guó))消化殘留的RNA雜質(zhì)，基因組DNA樣品稀釋至100 ng/μL，1.5 μg基因組DNA在95℃ 5 min變性后，將DNA樣品點(diǎn)在硝酸纖維素印跡膜上，于加熱器上干燥。膜干燥后進(jìn)行UV交聯(lián)2 min。隨后用3% TBST室溫封閉2 h。封閉完成后，于室溫下與一抗(5mC抗體，1∶1 000稀釋)孵育3 h(或4℃過(guò)夜孵育)。接著將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG抗體(1∶4 000稀釋)在37℃孵育60 min。用四唑淡藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(NBT/BCIP)顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色結(jié)束后，將膜置于終止液中清洗以終止顯色，拍照成像，進(jìn)行dot blot檢測(cè)。

將5-aza-dC處理12, 24和48 h后的Bm12細(xì)胞通過(guò)EVOS FL Auto熒光顯微鏡(Thermo Fisher, Waltham, 美國(guó))進(jìn)行觀察和成像，隨后通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算每8 000 μm2的Bm12細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，探究DNA甲基化對(duì)家蠶細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.3 LC3蛋白的過(guò)表達(dá)和Western blot檢測(cè)

LC3可用來(lái)指示細(xì)胞自噬程度(Tanidaetal., 2004)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化調(diào)控家蠶細(xì)胞自噬的強(qiáng)度，我們構(gòu)建3×FLAG-LC3過(guò)表達(dá)載體。提取Bm12細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為擴(kuò)增LC3基因的模板。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)擴(kuò)增家蠶LC3基因的ORF區(qū)域，通過(guò)上游引物在LC3蛋白氨基端引入3×FLAG標(biāo)簽，進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系: 2×Hieff PCR Master Mix(Yesen, 廣州) 10 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 無(wú)核酸酶水6.4 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s, 32個(gè)循環(huán); 4℃保持。利用DNA凝膠回收試劑盒(Magen, 廣州)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收?；厥盏腄NA片段連接到pMD-18T(TaKaRa, 大連)載體上。隨后利用KpnⅠ和BamHⅠ酶將目的片段從pMD-18T載體上切下來(lái)連入pEGFP載體，構(gòu)建3×FLAG-LC3-EGFP載體。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

將構(gòu)建好的2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表達(dá)載體和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美國(guó))加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island, 美國(guó))無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足到50 μL，充分混合。將配好的混合液室溫靜置15 min，加入到家蠶卵巢Bm12細(xì)胞培養(yǎng)液12孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中加入1 μg 5-aza-dC處理。24和48 h后分別收集Bm12細(xì)胞的總蛋白。蛋白變性后在12% SDS-PAGE凝膠中分離，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素印跡膜(GE Healthcare)。將膜置于含有3% (w/v) BSA的TBST中37℃封閉2 h或4℃封閉過(guò)夜。封閉結(jié)束后，用TBST洗膜3次，加入1% TBST稀釋1∶2 000的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美國(guó))，37℃孵育3 h或4℃過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(IA-0071, Dingguo, 北京)，室溫孵育1～2 h。室溫下用TBST洗膜2次和TBS洗膜1次，最終用NBT/BCIP顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色結(jié)束后，將膜置于終止液中清洗以終止顯色，最后將顯色好的膜取出，拍照。

1.4 免疫組化

將家蠶卵巢Bm12細(xì)胞以合適的密度接種到12孔細(xì)胞板的爬片上， 待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表達(dá)載體和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美國(guó))加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island,美國(guó))無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足到50 μL，充分混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染。同時(shí)加入1 μg 5-aza-dC處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10～20 min，隨后用含0.5% Triton的PBT處理，于室溫通透30 min。用含有2% BSA和5%山羊血清的封閉液，于室溫封閉2 h。封閉完成后，于室溫下以1∶200稀釋的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美國(guó))孵育3 h(或4℃過(guò)夜孵育)。再以1∶200 Alexa-594標(biāo)記的二抗(Invitrogen, 美國(guó))孵育2 h。每?jī)蓚€(gè)步驟之間用0.1% PBT洗3次。二抗孵育且PBT洗后，用Prolong Gold/DAPI (Invitrogen, 美國(guó))染色封片后，使用FV3000共聚焦顯微鏡(Olympus, 日本)進(jìn)行觀察FLAG-LC3I/II的分型情況。

1.5 DNA甲基化對(duì)細(xì)胞自噬和家蠶翅發(fā)育的影響

為了探究DNA甲基化是否影響細(xì)胞自噬和家蠶翅的發(fā)育，選取50～60頭預(yù)蛹期的家蠶，在冰上放置30 min，從腹部第2胸節(jié)注射2 μg 5-aza-dC，對(duì)照組注射相同體積的ddH2O，觀察成蟲(chóng)翅形態(tài)，計(jì)算殘翅率和翅面積，并在24, 48, 72和96 h檢測(cè)Atg基因mRNA水平變化。同時(shí)，為了明確細(xì)胞自噬對(duì)家蠶翅發(fā)育的影響，選取50～60頭同時(shí)期生長(zhǎng)良好的預(yù)蛹期家蠶，在胸腔處注射2 μg的細(xì)胞自噬激活劑SMER28(Tianetal., 2011)(SC5502 Beyotime, 上海)，對(duì)照組注射相同體積的ddH2O，24，48和72 h后觀察羽化后成蟲(chóng)的翅形態(tài)，計(jì)算殘翅率和翅面積。Spautin-1是一種特異的細(xì)胞自噬抑制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)USP10和USP13的去泛素化活性減少PtdIns3P的水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞的自噬(Liuetal., 2011)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化調(diào)控家蠶翅發(fā)育是由細(xì)胞自噬介導(dǎo)的，選取50～60頭預(yù)蛹期家蠶，對(duì)照組注射相同體積ddH2O，一組實(shí)驗(yàn)組注射2 μg 5-aza-dC，另外一組實(shí)驗(yàn)組同時(shí)注射2 μg 5-aza-dC和2 μg Spautin-1(SC5498 Beyotime, 上海)進(jìn)行細(xì)胞自噬抑制劑挽救實(shí)驗(yàn)，24，48和72 h后統(tǒng)計(jì)羽化后成蟲(chóng)的殘翅率和翅面積。每組實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取9～15頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每組進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 溶酶體染色檢測(cè)DNA甲基化對(duì)細(xì)胞自噬強(qiáng)度的影響

細(xì)胞自噬是一個(gè)基于溶酶體的胞內(nèi)降解過(guò)程，胞內(nèi)組分被自噬小體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解，從而提供特殊環(huán)境下細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)，因此，細(xì)胞內(nèi)溶酶體水平可以反映自噬強(qiáng)度。為了檢測(cè)5-aza-dC處理是否影響了細(xì)胞內(nèi)的溶酶體水平，在室溫下利用LysoTrackerTMGreen DND-26溶酶體綠色熒光探針(L7526, Invitrogen, California, 美國(guó))溶液(LysoTrackerTMGreen DND-26∶PBS=1∶300)對(duì)5-aza-dC處理的Bm12細(xì)胞(1.2節(jié))和家蠶翅(1.5節(jié))、細(xì)胞自噬激活劑SMER28處理的家蠶翅(1.5節(jié))和細(xì)胞自噬抑制劑Spautin-1挽救實(shí)驗(yàn)家蠶翅(1.5節(jié))進(jìn)行室溫染色20 min，染色結(jié)束后PBS洗6次后放到載玻片上，蓋上蓋玻片，封片處理。蓋蓋玻片時(shí)應(yīng)注意保護(hù)組織的原結(jié)構(gòu)。最后于FV3000共聚焦顯微鏡(Olympus, 日本)下觀察并拍照成像，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞內(nèi)的溶酶體熒光信號(hào)數(shù)量。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)5-aza-dC對(duì)Atg基因表達(dá)的影響

為了檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(Atg)基因(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)的表達(dá)水平，根據(jù)Eastep?Super總RNA提取試劑盒(Promega, Madison, 美國(guó))說(shuō)明書(shū)提取5-aza-dC處理的Bm12細(xì)胞(1.2節(jié))和家蠶翅(1.5節(jié))的總RNA。隨后，按Evo M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega, Madison, 美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)家蠶翅細(xì)胞的內(nèi)參基因線粒體蛋白49基因(RP49)和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白基因Atg的RT-qPCR特異引物(表1)，合成后使用Eastep?qPCR Master Mix試劑盒(Promega, Madison, 美國(guó))通過(guò)QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系: Eastep?qPCR Master Mix 10 μL, Bm12細(xì)胞或家蠶翅cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 無(wú)核酸酶水7.2 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)后于4℃保持?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001)，所有數(shù)據(jù)為3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)均為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果的差異顯著性由t檢驗(yàn)分析得出。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化對(duì)家蠶Bm12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

dot blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1: A)，1 μg 5-aza-dC顯著降低Bm12細(xì)胞基因組5mC的水平，可以作為一種有效的抑制劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1 μg 5-aza-dC處理12, 24和48 h的Bm12細(xì)胞生長(zhǎng)受到了明顯的影響，與對(duì)照組相比Bm12細(xì)胞數(shù)量分別減少15.85%，19.96%和26.81%(圖1: B)，表明DNA甲基化參與調(diào)控家蠶細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

圖1 DNA甲基化抑制劑5-aza-dC(1 μg)對(duì)家蠶卵巢Bm12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on the growth of Bombyx mori ovarian Bm12 cellsA: 利用5mC抗體通過(guò)dot blot分析5-aza-dC處理后的Bm12細(xì)胞中DNA甲基化水平Dot blot analysis of DNA methylation levels in Bm12 cells treated with 5-aza-dC using 5mC antibody. Input: 1.5 μg等量DNA通過(guò)核酸染料(GoldView)染色后成像Image of the same amount of DNA (1.5 μg) after staining with nucleic acid dye (GoldView). B: 5-aza-dC處理后顯微鏡視野下每8 000 μm2的Bm12細(xì)胞數(shù)量Number of Bm12 cells per 8 000 μm2 in the microscope field after treatment with 5-aza-dC. CK: H2O; 5mC: 5-甲基胞嘧啶5-Methylcytosine. 下同The same below. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上星號(hào)示與對(duì)照組間的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significance of difference from the control (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t-test). 下同The same below.

2.2 DNA去甲基化促進(jìn)家蠶細(xì)胞的自噬水平

對(duì)轉(zhuǎn)染了3×FLAG-LC3-EGFP超表達(dá)載體的Bm12細(xì)胞進(jìn)行5-aza-dC處理，24和48 h后利用FLAG抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖2: A左)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細(xì)胞內(nèi)有更多的LC3-I被加工轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II，并且處理48 h后細(xì)胞中的LC3-II多于處理24 h細(xì)胞中的。免疫組化實(shí)驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果(圖2: A右)，經(jīng)過(guò)5-aza-dC處理后的細(xì)胞內(nèi)含有更多的呈聚集狀的LC3-II蛋白亮點(diǎn)。

溶酶體染色檢測(cè)結(jié)果表明，1 μg 5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細(xì)胞內(nèi)的溶酶體熒光信號(hào)強(qiáng)度增加(圖2: B)，熒光信號(hào)數(shù)量與對(duì)照比較極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2: C)。Atg基因表達(dá)量的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，在5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細(xì)胞內(nèi)，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18表達(dá)水平與對(duì)照比較極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2: D)，表明DNA甲基化可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬來(lái)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

圖2 DNA甲基化抑制劑5-aza-dC (1 μg)對(duì)家蠶Bm12細(xì)胞中自噬的影響Fig. 2 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on autophagy in Bm12 cells of Bombyx moriA: Western blot (左)和免疫組化(右，箭頭指示LC3-Ⅱ)分析5-aza-dC處理對(duì)LC3蛋白分型(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的影響Western blot (left) and immunohistochemistry (right, arrows pointing LC3-Ⅱ) analyses of LC3 protein typing (LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ) in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC處理對(duì)Bm12細(xì)胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC處理后Bm12中細(xì)胞溶酶體熒光信號(hào)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC處理48 h后Bm12細(xì)胞中Atg基因的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)Relative expression levels of Atg genes in Bm12 cells treated with 5-aza-dC for 48 h.

2.3 DNA甲基化參與調(diào)控家蠶翅的發(fā)育

結(jié)果表明，預(yù)蛹期注射5-aza-dC后的家蠶成蟲(chóng)出現(xiàn)大量的畸形翅，翅面積減小，厚度變薄(圖3: A)，成蟲(chóng)殘翅率達(dá)到91.67%，而對(duì)照組的殘翅率僅19.05%(圖3: B)。翅面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組翅面積比對(duì)照組減少了66%(圖3: C)，說(shuō)明DNA去甲基化造成家蠶翅的異常發(fā)育。檢測(cè)5-aza-dC處理的家蠶翅中Atg基因的表達(dá)水平，如圖3(D)所示，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18在注射后96 h內(nèi)的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。對(duì)注射5-aza-dC后的家蠶翅進(jìn)行溶酶體染色實(shí)驗(yàn)，獲得了與在Bm12細(xì)胞株中(圖2)相似的結(jié)果，即DNA去甲基化增強(qiáng)了家蠶蛹翅細(xì)胞內(nèi)的自噬水平(圖3: E, F)。

圖3 家蠶預(yù)蛹注射DNA甲基化抑制劑5-aza-dC (2 μg)后對(duì)成蟲(chóng)翅發(fā)育的影響Fig. 3 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (2 μg) injected into prepupaeon the wing development of Bombyx mori adultsA: 5-aza-dC注射后成蟲(chóng)翅的表型Adult wing phenotype after injection with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC注射后成蟲(chóng)的殘翅率Abnormal wing rate of adult after injection with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC注射后成蟲(chóng)的翅面積變化Change of wing area of adult after injection with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC注射不同時(shí)間后翅中Atg基因的相對(duì)表達(dá)水平Relative expression levels of Atg genes in wing after injection with 5-aza-dC for different time; E: 5-aza-dC注射不同時(shí)間后翅細(xì)胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time; F: 5-aza-dC注射不同時(shí)間后翅細(xì)胞溶酶體熒光信號(hào)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time.

2.4 DNA甲基化通過(guò)細(xì)胞自噬影響家蠶翅發(fā)育

預(yù)蛹期注射細(xì)胞自噬激活劑SMER28后24, 48和72 h，與對(duì)照組比較，成蟲(chóng)出現(xiàn)了類似注射5-aza-dC后(圖3: A)的翅表型，即成蟲(chóng)出現(xiàn)了畸形翅(圖4: A)，殘翅率從對(duì)照的12%升高到87.13%(圖4: B)，成蟲(chóng)翅面積降低48.79%(圖4: C)，且翅細(xì)胞的溶酶體熒光信號(hào)強(qiáng)度增加(圖4: D)，熒光信號(hào)數(shù)顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4: E)，證明家蠶翅細(xì)胞自噬的異常上調(diào)確實(shí)可以影響翅的正常發(fā)育。

圖4 家蠶預(yù)蛹注射細(xì)胞自噬激活劑SMER28(2 μg)對(duì)成蟲(chóng)翅發(fā)育的影響Fig. 4 Effects of autophagy activator SMER28 (2 μg) injected into prepupae on the wing development of Bombyx mori adultsA: 注射SMER28后成蟲(chóng)翅表型Adult wing phenotype after injection with SMER28; B: 注射SMER28后成蟲(chóng)殘翅率變化Change of abnormal wing rate of adult after injection with SMER28; C: 注射SMER28后成蟲(chóng)的翅面積變化Change of wing area of adult after injection with SMER28; D: SMER28注射不同時(shí)間后翅細(xì)胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with SMER28 for different time; E: SMER28注射不同時(shí)間后翅細(xì)胞溶酶體熒光信號(hào)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with SMER28 for different time.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化調(diào)控家蠶翅發(fā)育是由細(xì)胞自噬介導(dǎo)的，我們對(duì)5-aza-dC(2 μg)處理的家蠶預(yù)蛹進(jìn)行注射細(xì)胞自噬抑制劑Spautin-1(2 μg)的挽救實(shí)驗(yàn)。 如圖5(A-C)所示，對(duì)照組成蟲(chóng)殘翅率為16.28%, 5-aza-dC處理組的為92.31%，注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救組的為47.7%；對(duì)照組翅面積為每翅59.77 mm2, 5-aza-dC組的為每翅20.29 mm2, Spautin-1挽救組的為每翅42.33 mm2。如圖5(D和E)所示，與對(duì)照組相比5-aza-dC處理后的家蠶翅細(xì)胞溶酶體熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，熒光信號(hào)數(shù)顯著上調(diào)(P<0.05)，而注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救組家蠶翅細(xì)胞內(nèi)的溶酶體信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的回落，證明細(xì)胞自噬抑制劑Spautin-1確實(shí)可以挽救由DNA去甲基化引起的細(xì)胞自噬。

圖5 DNA甲基化通過(guò)細(xì)胞自噬影響家蠶翅的發(fā)育Fig. 5 DNA methylation affects the wing development of Bombyx mori through autophagyA: 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和Spautin-1挽救組的成蟲(chóng)翅表型Adult wing phenotype in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; B: 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和Spautin-1挽救組的成蟲(chóng)殘翅率變化Change of abnormal wing rate of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; C: 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和Spautin-1挽救組的成蟲(chóng)翅面積變化Change of wing area of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; D: 處理不同時(shí)間后翅細(xì)胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after treatment for different time; E: 處理不同時(shí)間后翅細(xì)胞溶酶體熒光信號(hào)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after treatment for different time. 5-aza-dC: 甲基化抑制劑Methylation inhibitor (2 μg); Spautin-1: 細(xì)胞自噬抑制劑Autophagy inhibitor (2 μg).

3 討論

生物學(xué)功能方面的研究表明，盡管昆蟲(chóng)基因組內(nèi)的DNA甲基化率較低(<1%)(Bewicketal., 2017)，其依然在調(diào)控昆蟲(chóng)發(fā)育中起著重要作用。然而目前對(duì)DNA甲基化影響昆蟲(chóng)發(fā)育的研究大都停留在昆蟲(chóng)DNMT基因敲除后的表型觀察，DNA甲基化如何具體調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究仍然相對(duì)匱乏。本研究選取鱗翅目的模型昆蟲(chóng)家蠶為研究對(duì)象，采用DNA甲基化抑制劑5-aza-dC進(jìn)行DNA甲基化功能研究。5-aza-dC不僅在治療慢性粒細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合癥和急性髓細(xì)胞性白血病等臨床實(shí)踐中被應(yīng)用(Goreetal., 2006; Malik and Cashen, 2014)，還涉及性發(fā)育(Ribasetal., 2017)、植物成熟(Zhongetal., 2013)和基因表達(dá)(Chiurazzietal., 1999; Slacketal., 1999)等方面的研究。本研究證明1 μg 5-aza-dC處理的家蠶細(xì)胞DNA甲基化水平顯著下降(圖1)，表明5-aza-dC在鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞中也可以發(fā)揮去甲基化的作用。

目前對(duì)昆蟲(chóng)DNA甲基化的功能研究表明，DNA甲基化涉及生殖、級(jí)型分化、翅發(fā)育和性別決定等多種生理生化過(guò)程，例如在蝽Oncopeltusfasciatus(Bewicketal., 2019)、家蠶 (Xiangetal., 2013; Lietal., 2020)、麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis(Wangetal., 2013)和德國(guó)小蠊Blattellagermanica(Ventós-Alfonsoetal., 2020)中，敲除DNMT基因會(huì)致使卵巢和胚胎發(fā)育受阻，產(chǎn)卵量/卵孵化率下降和滯育等。對(duì)不同種群與性別的蜂群/蟻群的基因組甲基化分析也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化也可能調(diào)控昆蟲(chóng)的社會(huì)分工與性別決定(Lykoetal., 2010; Bigotetal., 2011)。我們的早期工作表明DNA甲基化通過(guò)抑制幾丁質(zhì)酶而參與調(diào)控了家蠶翅的發(fā)育(Xuetal., 2020)，本研究發(fā)現(xiàn)家蠶預(yù)蛹翅在正常發(fā)育情況下表現(xiàn)出較低水平的細(xì)胞自噬，這與大量關(guān)于昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育的研究相吻合。昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的中腸、脂肪體和神經(jīng)等組織細(xì)胞都發(fā)生著細(xì)胞自噬和凋亡(Wuetal., 2006; Weaver and Krasnow, 2008; 張淑堯等, 2019)。家蠶翅原基的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬研究發(fā)現(xiàn)，5齡幼蟲(chóng)以及幼蟲(chóng)末期的家蠶翅原基細(xì)胞內(nèi)的凋亡和自噬相關(guān)基因普遍具有高水平的表達(dá)，如Caspase3,Atg5,Atg6,Atg8和Atg12等；而在家蠶進(jìn)入預(yù)蛹期后，蛹翅細(xì)胞內(nèi)的凋亡和自噬相關(guān)基因顯著下降，暗示細(xì)胞凋亡和自噬可能調(diào)控了變態(tài)發(fā)育時(shí)期翅原基向蛹翅的發(fā)育，而進(jìn)入蛹期后其調(diào)控作用消失(劉學(xué)術(shù)等, 2016)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bm12細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化水平降低導(dǎo)致Atg基因表達(dá)上調(diào)(圖2)，促進(jìn)家蠶翅的細(xì)胞自噬，進(jìn)而導(dǎo)致翅發(fā)育異常，形成畸形翅(圖3)，這表明在正常發(fā)育情況下DNA甲基化控制細(xì)胞的自噬從而使其維持在一定的水平，進(jìn)而保證家蠶翅發(fā)育的有序進(jìn)行。通過(guò)藥物處理實(shí)驗(yàn)也證明DNA甲基化抑制劑5-aza-dC和細(xì)胞自噬激活劑SMER28都可以影響家蠶翅的發(fā)育，造成畸形翅。而細(xì)胞自噬抑制劑Spautin-1在一定程度上可以挽救5-aza-dC處理造成的翅發(fā)育畸形，表明DNA甲基化可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬的形成來(lái)參與家蠶翅的發(fā)育(圖4和5)，因此，我們推測(cè)蛹期家蠶翅的正常發(fā)育需要DNA甲基化抑制細(xì)胞自噬水平，使細(xì)胞自噬維持在相對(duì)較低的水平。

大量的研究表明細(xì)胞自噬是生物體發(fā)育的一種保護(hù)機(jī)制。昆蟲(chóng)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)對(duì)果蠅和家蠶脂肪體和中腸等組織的細(xì)胞自噬發(fā)生起著重要的調(diào)控功能。20E一方面可以通過(guò)促進(jìn)家蠶細(xì)胞中的Atg基因表達(dá)上調(diào)；另一方面又可以通過(guò)抑制營(yíng)養(yǎng)信號(hào)mTOR活性而激活家蠶Atg1/Atg13蛋白復(fù)合體活性，啟動(dòng)自噬小體的形成，從而誘導(dǎo)幼蟲(chóng)表皮和組織的細(xì)胞發(fā)生高水平的自噬，執(zhí)行細(xì)胞程序性死亡，保障家蠶正常的變態(tài)進(jìn)程(Leeetal., 2002; Tianetal., 2013; 謝昆等, 2013)。除了激素外，細(xì)胞自噬也同樣受到DNA甲基化的調(diào)控，DNA甲基化不僅可以直接修飾自噬相關(guān)基因，還可以影響一些調(diào)節(jié)自噬的信號(hào)分子基因，從而影響它們的轉(zhuǎn)錄和隨后的細(xì)胞自噬(Hu, 2019)。例如，DNA甲基化一方面可以直接修飾Atg1,Atg6,Atg8和LC3等細(xì)胞自噬相關(guān)基因，通過(guò)調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞自噬水平，另一方面也可以修飾一些細(xì)胞自噬相關(guān)的信號(hào)分子基因間接影響細(xì)胞自噬強(qiáng)度，如NOR1,DAPK和SOX1基因等(Hu, 2019)。同樣地，最近的研究也表明，組蛋白修飾和非編碼RNA(如microRNA)也是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要表觀遺傳方式，尤其是H4K16ac和H3K56ac(Füllgrabeetal., 2014; Hu, 2019)。本研究中，對(duì)家蠶成蟲(chóng)翅的研究發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化可以使原本較低水平的細(xì)胞自噬大幅度提高，表明DNA甲基化在家蠶變態(tài)的關(guān)鍵時(shí)期(蛹期)抑制細(xì)胞的自噬，避免由于細(xì)胞自噬水平過(guò)高而影響翅發(fā)育的正常進(jìn)程。然而，DNA甲基化是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)、免疫或20E信號(hào)通路互作對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控，還是直接調(diào)控自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞自噬的水平還需要更多的研究來(lái)證明。綜上所述，DNA甲基化調(diào)控細(xì)胞自噬的研究尚處于初級(jí)階段，目前只有少數(shù)細(xì)胞自噬相關(guān)基因或信號(hào)分子被報(bào)道發(fā)生DNA甲基化，從而影響自噬水平。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)DNA甲基化也可以調(diào)控家蠶蛹翅中幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)酶表達(dá)來(lái)影響幾丁質(zhì)的代謝，從而影響蛹翅的發(fā)育(Xuetal., 2017, 2018, 2020)。那么，DNA甲基化是否通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞自噬和幾丁質(zhì)代謝在家蠶翅細(xì)胞的發(fā)生，以保證翅的正常發(fā)育也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。