姚若彤， 趙婧媛， 閆一欣， 段立蓉， 王 恬，嚴(yán) 佳， 張淑軍， 李 剛,2

(1. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學(xué) 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室， 江蘇 蘇州 215123； 3. 北卡羅萊納州立大學(xué) 紡織學(xué)院， 羅利 27695)

周圍神經(jīng)損傷在臨床病癥中十分常見，占據(jù)了所有外科創(chuàng)傷病例的2%～5%[1]。自然災(zāi)害或意外事故都會對人體周圍神經(jīng)造成不同程度的損傷，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷性或非創(chuàng)傷性疾病、感覺不良，甚至是癱瘓[2]。當(dāng)周圍神經(jīng)的缺損距離較短(小于5 mm)時，可以直接通過手術(shù)縫合的方式進行修復(fù)，但對于長距離(缺損距離大于受損神經(jīng)直徑4倍以上或者缺損長度大于3 cm)的神經(jīng)損傷，直接縫合會使得縫合線處的張力較大，導(dǎo)致手術(shù)效果不理想[3]。對此，臨床上常使用的治療方案是自體移植和異體移植，自體神經(jīng)移植是修復(fù)周圍神經(jīng)受損的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，但其也因供體不足、供區(qū)功能受損以及神經(jīng)瘤的形成而具有一定的局限性[5]，異體移植可能會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和交叉感染等問題[6]。基于此，人工神經(jīng)移植成為治療周圍神經(jīng)損傷的熱點研究方向。

神經(jīng)導(dǎo)管需具備良好的力學(xué)性能、生物相容性和一定的引導(dǎo)性，目前針對神經(jīng)導(dǎo)管性能的改善工作主要從材料選擇和結(jié)構(gòu)設(shè)計兩方面進行[7]。常用的材料主要有生物降解材料、非生物降解材料和生物衍生材料[8]，其中生物降解材料來源廣泛，具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性能，是植入體內(nèi)的首選材料之一[9]。蠶絲理化性質(zhì)優(yōu)良，同時具有良好的力學(xué)性能和生物相容性[10]，絲素蛋白約占蠶絲總質(zhì)量的80%[11-12]，以絲素蛋白為原料制作的神經(jīng)導(dǎo)管在體內(nèi)炎癥反應(yīng)低且可進行生物降解，能夠有效促進受損神經(jīng)的功能恢復(fù)[13]；殼聚糖具有抗菌和抑制炎癥反應(yīng)的作用[14]。鎂元素作為人體內(nèi)必不可少的微量元素，在適宜的微環(huán)境下能夠促進雪旺氏細胞的增殖，如分泌生長因子和細胞外基質(zhì)等，從而改善周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)[15]。靜電紡納米纖維與細胞外基質(zhì)具有相似結(jié)構(gòu)，為細胞的黏附與增殖提供仿生微環(huán)境，同時可負載藥物用于在受損部位構(gòu)建藥物釋放系統(tǒng)[16-17]，但純納米纖維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且中空結(jié)構(gòu)的導(dǎo)管缺乏對軸突再生的結(jié)構(gòu)性支撐。

本文將傳統(tǒng)編織技術(shù)、靜電紡絲和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，軸紗與編織紗緊密交織形成穩(wěn)定的編織結(jié)構(gòu)，起到力學(xué)支撐的作用，而導(dǎo)管內(nèi)腔的海綿層結(jié)構(gòu)為軸突生長提供了物理引導(dǎo)，同時為細胞的黏附和增殖提供穩(wěn)定空間。以絲素蛋白溶液、蠶絲紗、殼聚糖和氧化鎂為原料制備了一種含有殼聚糖涂層-編織層-納米纖維海綿層的3層復(fù)合結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管支架，并對其外觀形貌進行表征，討論了導(dǎo)管軸紗、內(nèi)外層結(jié)構(gòu)對力學(xué)性能的影響，同時研究了導(dǎo)管在體外實驗條件下的離子緩釋性能和細胞相容性。

1 實驗部分

1.1 材料與設(shè)備

生絲(4A級)，桑蠶絲線(5、9 tex)，嵊州市協(xié)和絲綢有限公司；殼聚糖(BR脫乙酰度95%)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；納米氧化鎂粉體(粒徑20 nm，純度98%)，江蘇先豐納米材料科技有限公司；鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)，上海麥克林生化科技有限公司；無水碳酸鈉(AR)、聚乙二醇，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溴化鋰(AR)，上海阿拉丁試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值為7.4)，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；高糖培養(yǎng)基(DMEM)，美國Gibco公司；1%鏈霉素-青霉素，美國Gibco公司；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒(1 000 U)，蘇州碧云天生物技術(shù)。

SFJ-Y-C32型立式錠子編織機，上海哈考線帶設(shè)備有限公司；TL-Pro-BM型靜電紡絲機，深圳通力微納有限公司；ALPHA 2-4 LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司；TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC；5967萬能材料試驗機，美國英斯特朗公司；S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；TM3030型能譜儀，日本日立公司；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國尼高利科學(xué)儀器技術(shù)公司；AA240FS-GTA120型原子吸收光譜儀，美國瓦里安公司；酶聯(lián)免疫檢驗儀6500，美國Wisdom公司。

1.2 神經(jīng)導(dǎo)管制備

1.2.1 絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜的制備

將30 g生絲與一定量的無水碳酸鈉放入沸水中煮沸30 min，進行脫膠處理，沖洗2～3次后放置在通風(fēng)處進行干燥[18]。將干燥后的脫膠蠶絲溶解于濃度為9.3 mol/L的100 mL溴化鋰溶液中，在60 ℃ 的恒溫箱中靜置4 h，得到淡黃色透明的絲素蛋白溶液[19]。將溶液裝入透析袋，放入去離子水中透析36 h，隨后再次放入15%的聚乙二醇溶液中，將其置于磁力攪拌器上不斷攪拌，48 h后絲素蛋白的含量上升為24%～28%[20]。配置一定濃度梯度的鎂離子溶液，質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.015和0.02 g/mL，將其與一定量的絲素蛋白溶液均勻混合，得到絲素含量為24%的絲素蛋白/鎂離子溶液。利用靜電紡絲技術(shù)，在20 kV電壓下，保持針頭與接收器之間的距離為25 cm，紡絲推速為0.2 mL/h，制備纖維膜結(jié)構(gòu)完整均勻的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜[21]。

1.2.2 編織結(jié)構(gòu)層的設(shè)計

采用立式錠子編織機，分別以5和9 tex的桑蠶絲線為軸紗和編織紗，制備內(nèi)徑為2 mm的三維管狀編織物[9]，作為導(dǎo)管的中間層結(jié)構(gòu)。為討論編織層中軸紗對導(dǎo)管性能的影響，實驗同時設(shè)置無軸紗編織層作為對照組。

1.2.3 殼聚糖涂層的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的殼聚糖溶液涂覆于編織層外層上，經(jīng)烘箱干燥后形成殼聚糖涂層。殼聚糖降解過程中生成殼寡糖，起到抑制炎癥反應(yīng)和細胞感染的作用[22]。

1.2.4 海綿結(jié)構(gòu)層的制備

將1.2.1中制備的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜經(jīng)乙醇處理后裁剪成細小的短纖維，均勻分散于6%的殼聚糖溶液中，利用注射器將混合溶液注入導(dǎo)管內(nèi)腔，放入-80 ℃的低溫冰箱中冷凍2 d，利用真空干燥機冷凍干燥3 d，得到含納米纖維的海綿層結(jié)構(gòu)。

1.2.5 神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)設(shè)計

為探究軸紗和內(nèi)外層結(jié)構(gòu)對神經(jīng)導(dǎo)管力學(xué)性能的影響，本文以這2種要素為變量，通過設(shè)置不同的排列組合方式，制備4種結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管，如表1所示。通過對相應(yīng)測試結(jié)果進行分析，找到最優(yōu)化的材料組合比例和結(jié)構(gòu)設(shè)計方案。

表1 神經(jīng)導(dǎo)管的制備參數(shù)

1.3 結(jié)構(gòu)與性能測試

1.3.1 形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡對4個濃度梯度的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜的形貌進行觀察，利用Image-J 軟件分別在每個樣品中選取100根纖維進行直徑測量，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后分析其分布情況。同時，對制備的神經(jīng)導(dǎo)管進行橫向切片處理，利用掃描電子顯微鏡分別對含/不含海綿層的導(dǎo)管截面及管壁進行觀察，利用Image-J軟件測量每個海綿層中的100個孔徑直徑，繪制孔徑分布圖，對海綿層中的孔徑直徑大小和分布情況進行測試分析。

1.3.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

以經(jīng)過乙醇處理的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜和未經(jīng)處理的納米纖維膜為樣品，利用傅里葉紅外光譜儀進行測試，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，對得到的數(shù)據(jù)進行處理，繪制出紅外光譜圖。

1.3.3 試樣表面元素含量測試

分別在4種濃度梯度的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜上取樣，使用能譜儀分析每個樣品中的C、O、Mg 3種元素的含量，得到數(shù)據(jù)匯總成表格。

1.3.4 力學(xué)性能測試

取長度為5 cm的4組不同結(jié)構(gòu)的導(dǎo)管作為樣品，每組設(shè)置3個平行樣。利用TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀檢測導(dǎo)管的軸向壓縮性能，壓縮位移為導(dǎo)管直徑的50%，壓縮速度為15 mm/min，測試徑向所能承受的最大擠壓力，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差并繪制數(shù)據(jù)圖；拉伸性能測試在萬能材料試驗機上進行，夾持距離為20 mm，加載速度為100 mm/min，拉伸樣品直至軸紗斷裂，繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖[23]。

1.3.5 鎂離子緩釋性能測試

分別將含有不同鎂離子質(zhì)量濃度的導(dǎo)管樣品浸入10 mL、pH值為7.4的PBS溶液中，放置于37 ℃恒溫箱，培養(yǎng)至固定時間(1、3、7、14、28 d) 后取出1 mL 培養(yǎng)液，同時配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用原子吸收光譜儀檢測溶液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定鎂離子質(zhì)量濃度，做出鎂離子質(zhì)量濃度-時間關(guān)系曲線圖。

1.3.6 細胞實驗

細胞實驗材料采用大鼠神經(jīng)雪旺氏細胞，培養(yǎng)基的組成成分為89%的DMEM，10%的胎牛血清和1%的鏈霉素-青霉素雙抗。將直接培養(yǎng)在24孔細胞培養(yǎng)板中的細胞作為對照組，實驗組則將細胞分別培養(yǎng)在鎂離子質(zhì)量濃度為0、0.01和0.02 g/mL的神經(jīng)導(dǎo)管中。將大鼠神經(jīng)雪旺氏細胞復(fù)蘇后，放入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進行增殖，同時將導(dǎo)管樣品切成5 mm，輻照滅菌處理。接種細胞后，將樣品放入完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)[24]。在第1、3、5、7 d后取出對照組和實驗組，更換新的24孔板。每孔放入1個樣品并加入100 μL含有CCK-8試劑的培養(yǎng)基，利用酶聯(lián)免疫檢驗儀測其在450 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度值估計細胞數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜微觀結(jié)構(gòu)

2.1.1 表觀形貌分析

利用靜電紡絲技術(shù)紡制的納米纖維膜具有較大的比表面積，可很好地模擬細胞外環(huán)境，有助于神經(jīng)細胞黏附、增殖，從而促進受損神經(jīng)再生。圖1示出納米纖維的形貌及其直徑分布。可知在電鏡觀測下，含有不同質(zhì)量濃度納米級別氧化鎂粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%的絲素蛋白溶液均成功制備出了靜電紡絲薄膜。其中加入了0.02 g/mL氧化鎂所紡得的靜電紡絲纖維的均勻度及細度(0.6～0.9 μm)最好，加入了0.01 g/mL氧化鎂所紡得的靜電紡絲纖維的均勻度較好，但直徑(1.5～2 μm)較大，未加入納米氧化鎂和加入0.015 g/mL的氧化鎂所得到的靜電紡絲纖維的均勻度較好，細度分布主要集中于1～1.5 μm 和0.8～1.4 μm。

圖1 靜電紡納米纖維的形貌及其直徑分布

2.1.2 元素含量分析

表2示出靜電紡絲膜中C、O、Mg 3種元素的含量?？梢钥闯觯?組不同鎂離子質(zhì)量濃度的靜電紡絲薄膜中均含有微量鎂元素。其中0 g/mL實驗組中本不應(yīng)出現(xiàn)鎂元素，但結(jié)果中出現(xiàn)了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.010%的鎂元素，原因可能來自于選樣檢測時導(dǎo)致的微量殘留，但由于其含量極少，可忽略不計?？梢园l(fā)現(xiàn)，鎂元素在幾種鎂離子質(zhì)量濃度的靜電紡絲膜中分布不均，其原因是配置好的氧化鎂溶液在加入具有黏度的絲素蛋白溶液中時，即使通過攪拌等方式使其混合均勻，仍存在著分布不均的情況。

表2 含不同質(zhì)量濃度鎂離子的靜電紡絲薄膜的元素含量

2.1.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

固體狀態(tài)下，絲素蛋白具有Silk Ⅰ和Silk Ⅱ 2種構(gòu)型，其中：Silk Ⅰ構(gòu)型主要是無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，多在非結(jié)晶區(qū)；Silk Ⅱ構(gòu)型主要是β折疊的層狀結(jié)構(gòu)。表3示出絲素蛋白的主要吸收峰[24]。

表3 絲素蛋白的紅外光譜特征峰[24]

圖2示出靜電紡絲薄膜的紅外光譜測試結(jié)果。由圖可得，未經(jīng)乙醇處理的絲素蛋白膜的酰胺 Ⅰ和酰胺 Ⅱ結(jié)構(gòu)的特征峰位于1 655、1 541 cm-1處，表明其中絲素蛋白的主要結(jié)構(gòu)為Silk Ⅰ。經(jīng)過無水乙醇處理的絲素蛋白膜中，酰胺 Ⅰ和酰胺 Ⅱ的特征峰向低波數(shù)方向偏移，且峰形變寬，表明經(jīng)乙醇處理后，絲素蛋白中的結(jié)晶結(jié)構(gòu)從不穩(wěn)定的Silk Ⅰ 轉(zhuǎn)變成了穩(wěn)定的Silk Ⅱ。這種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變改變了絲素蛋白的降解性能，增強了絲素蛋白膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在制備導(dǎo)管海綿層結(jié)構(gòu)時，經(jīng)乙醇處理的納米纖維膜在殼聚糖溶液中不易溶解破壞，從而在一定程度上改善了導(dǎo)管的力學(xué)性能。

圖2 靜電紡絲薄膜的紅外光譜圖

2.2 神經(jīng)導(dǎo)管的形貌結(jié)構(gòu)分析

通過三向帶芯編織技術(shù)得到的編織層為內(nèi)徑2 mm 的中空管狀結(jié)構(gòu)，如圖3所示。其管壁清晰可見，編織紗和軸紗相互緊密交織形成編織結(jié)構(gòu)，編織結(jié)構(gòu)的主要作用是為復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)提供力學(xué)支撐，主要增強其軸向拉伸性能[25]。殼聚糖和靜電紡絲納米短纖維混合溶液注入編織層內(nèi)部后，經(jīng)過冷凍干燥形成納米纖維海綿層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可極大增強神經(jīng)導(dǎo)管的徑向壓縮性能。冷凍干燥后的納米纖維海綿層表面粗糙，多孔且相互連通。

圖3 復(fù)合編織結(jié)構(gòu)神經(jīng)導(dǎo)管的掃描電鏡照片

納米纖維海綿層中孔徑分布較為均勻，且主要集中在0.04～0.08 mm之間，有利于神經(jīng)細胞黏附與增殖且使神經(jīng)導(dǎo)管具有一定的滲透性，有助于受損神經(jīng)部位同周圍的組織環(huán)境進行水、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的交換[26]見圖4所示。

圖4 復(fù)合編織結(jié)構(gòu)神經(jīng)導(dǎo)管中納米纖維海綿層中的孔徑分布

2.3 神經(jīng)導(dǎo)管的力學(xué)性能分析

為研究編織結(jié)構(gòu)中軸紗以及納米纖維海綿層的力學(xué)作用，使用TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀對4組神經(jīng)導(dǎo)管樣品在形變50%下的徑向壓縮性能進行測量，結(jié)果如圖5所示。可知，編織結(jié)構(gòu)中有軸紗的神經(jīng)導(dǎo)管相對于無軸紗的神經(jīng)導(dǎo)管來說，徑向壓縮性能更好。具有納米纖維海綿層結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管其徑向壓縮性能比無納米纖維海綿層結(jié)構(gòu)的更好。同時，以海綿層為變量的2組神經(jīng)導(dǎo)管其徑向壓縮性能存在顯著差異，而改變軸紗并不會對壓縮性能產(chǎn)生顯著影響，由此可以說明，相較于軸紗，導(dǎo)管的納米纖維海綿層結(jié)構(gòu)是影響導(dǎo)管壓縮性能的主要因素。有軸紗有納米纖維海綿層的神經(jīng)導(dǎo)管的徑向壓縮性能大約為無軸紗無納米纖維海綿層的4倍，前者為1.3 N，后者為0.3 N，該結(jié)論為制備力學(xué)性能良好的復(fù)合結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管提供了依據(jù)。當(dāng)研究神經(jīng)導(dǎo)管的軸向拉伸性能時，以納米纖維海綿層為變量，可以發(fā)現(xiàn)，有納米海綿層的2組比相應(yīng)的無納米纖維層的2組的拉伸性能更優(yōu)異(見圖5(b))。但以有無軸紗為變量時，無軸紗的2組神經(jīng)導(dǎo)管明顯比有軸紗的2組神經(jīng)導(dǎo)管的拉伸性能更好，原因是在拉伸過程中，測試有軸紗的神經(jīng)導(dǎo)管組的拉伸性能時直致軸紗斷裂，而無軸紗的神經(jīng)導(dǎo)管組則到編織結(jié)構(gòu)被破壞。

圖5 神經(jīng)導(dǎo)管的力學(xué)性能

2.4 鎂離子的緩釋性能分析

鎂離子的緩釋速率會影響神經(jīng)導(dǎo)管在體內(nèi)的工作時間和效果。神經(jīng)導(dǎo)管放入人體后，納米纖維海綿層中的鎂離子會緩慢釋放，從而起到促進神經(jīng)中蛋白質(zhì)的合成和神經(jīng)細胞再生的作用。圖6示出鎂離子的緩釋曲線，顯示了第1、3、7、14、28 d鎂離子的累計釋放濃度。從整體來看，鎂離子緩釋濃度與樣品中所含藥物濃度成正相關(guān)，導(dǎo)管中的鎂離子質(zhì)量濃度越高，在相同時間內(nèi)釋放到環(huán)境中的鎂離子含量就越大。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)導(dǎo)管中鎂離子的質(zhì)量濃度為0.01、0.015和0.02 g/mL時，導(dǎo)管能在培養(yǎng)基中緩慢釋放鎂離子28 d，釋放出的質(zhì)量濃度水平保持在0.8～1.25 g/mL之間，不超過人體內(nèi)鎂離子含量極限值，所以是安全的。

圖6 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)鎂離子的緩釋曲線

2.5 神經(jīng)導(dǎo)管的細胞相容性分析

圖7示出神經(jīng)導(dǎo)管與細胞共培養(yǎng)第1、3、5、7 d的實驗結(jié)果。吸光度值可間接反映導(dǎo)管樣品中細胞的數(shù)量。圖中數(shù)據(jù)表明，3個實驗組(鎂離子質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.02 g/mL)中細胞的增殖情況相似。從第1～3 d，細胞大量增殖，之后增速放緩，細胞數(shù)量保持穩(wěn)定。其中含鎂離子導(dǎo)管樣品中細胞的增殖速度大于不含鎂離子的導(dǎo)管樣品。細胞逐漸在導(dǎo)管中充滿，之后從導(dǎo)管的兩端進入培養(yǎng)液中，這種情況可能導(dǎo)致細胞的增長速度保持不變甚至下降。在相同觀測時間內(nèi)，含有鎂離子的樣品中細胞數(shù)量大于對照組，表明了在導(dǎo)管內(nèi)加入鎂離子能夠促進細胞增殖，且隨著培養(yǎng)時間的延長，鎂離子對細胞增殖的促進效果越明顯。鎂離子濃度也會對細胞增殖產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)鎂離子質(zhì)量濃度為0.01～0.02 g/mL 時，隨著濃度的提高，導(dǎo)管樣品中的細胞數(shù)量有所增加，表明在這一濃度范圍內(nèi)，鎂離子質(zhì)量濃度與細胞數(shù)量成正相關(guān)。實驗結(jié)果同時證明了該神經(jīng)導(dǎo)管對細胞無明顯毒性，安全有效，具有良好的生物相容性。

圖7 CCK-8細胞增殖圖

3 結(jié) 論

本文利用編織技術(shù)、靜電紡絲和冷凍干燥制備三層結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管，通過形貌分析和力學(xué)性能表征，得到以下結(jié)論。

1)軸紗和海綿層結(jié)構(gòu)能夠改善導(dǎo)管的抗壓縮能力，使導(dǎo)管具有優(yōu)異的力學(xué)性能。其中海綿層表面粗糙，孔徑大小均勻，孔與孔之間相互連通，利于細胞黏附和環(huán)境中物質(zhì)的內(nèi)外交換。

2)神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)鎂離子能夠在體外微環(huán)境下長效穩(wěn)定釋放，且當(dāng)鎂離子質(zhì)量濃度為0.02 g/mL時，其對細胞增殖的促進效果更明顯。