姚尚辰 馮艷春 張夏 胡昌勤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

藥物雜質(zhì)因其可能對藥品安全性、有效性和質(zhì)量產(chǎn)生影響，目前已成為國內(nèi)外藥品監(jiān)管機構(gòu)重點關(guān)注的內(nèi)容之一。人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)頒布了多項針對雜質(zhì)的研究指導(dǎo)原則，如原料藥、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則(ICH Q3A、ICH Q3B)、殘留溶劑研究指導(dǎo)原則(ICH Q3C)、元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則(ICH Q3D)等[1-4]。近年來在國內(nèi)開展的仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價中，藥品審評中心也頒布了一系列評價技術(shù)指導(dǎo)原則/要求，其中雜質(zhì)的研究是關(guān)注的重點。在藥品審評審批要求的推動下，加之化學(xué)分析檢驗檢測技術(shù)的不斷提升，近年來藥物雜質(zhì)譜的研究得以蓬勃發(fā)展。

目前，中國藥典和國外通用藥典基本都采用高效液相色譜法(HPLC)檢測化學(xué)藥品中的有關(guān)物質(zhì)。伴隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對雜質(zhì)控制力度的加大，對復(fù)雜體系樣本中雜質(zhì)的分離分析成為雜質(zhì)譜控制的關(guān)鍵技術(shù)問題之一[5]，如何快速有效地對雜質(zhì)進行定位進而定量，成為亟待解決的熱點問題。此外，在標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行過程中，如何對方法進行評價、確認和轉(zhuǎn)移，也成為藥品質(zhì)量控制的難點[6]。鑒于傳統(tǒng)的抗生素類藥品多來源于發(fā)酵或半合成，其組分、雜質(zhì)組成復(fù)雜，純度相對較低，上述問題尤為突出。而采用適宜的雜質(zhì)對照品則可以較為直接地解決上述難題[7-8]。為解決日益凸顯的雜質(zhì)檢測、定位、控制以及復(fù)雜體系方法評價等問題，雜質(zhì)對照品的研制成為近年來中檢院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的重點，其主要圍繞著研制特定雜質(zhì)對照品和混合雜質(zhì)對照品兩個方向展開。本文重點介紹抗感染藥物雜質(zhì)對照品的研制策略與方法。

1 特定雜質(zhì)對照品

1.1 單個特定雜質(zhì)對照品

對于任一活性物質(zhì)(API)，其雜質(zhì)通常有多個來源，包括工藝雜質(zhì)、降解雜質(zhì)、原輔料混入的雜質(zhì)等，在其系列雜質(zhì)中，究竟著力于研究哪些特定雜質(zhì)并建立對照品是這一工作的關(guān)鍵。對現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未控制特定雜質(zhì)的API，科學(xué)地研制特定雜質(zhì)對照品，可以促進藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，提高藥品的內(nèi)在質(zhì)量。目前，特定抗感染藥物雜質(zhì)對照品的研制主要考慮以下3個因素：①雜質(zhì)是否具有明確的毒性反應(yīng)或與臨床中特定副反應(yīng)密切相關(guān)，如遺傳毒性雜質(zhì)和β-內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物雜質(zhì)等；②雜質(zhì)是否具有特定的毒性功能基團，并與母體化合物相比相對毒性反應(yīng)明顯增大；③雜質(zhì)是否可作為與工藝穩(wěn)定性密切相關(guān)的指針性雜質(zhì)。此外，對擬進行研制的雜質(zhì)對照品，還需具有來源清晰、結(jié)構(gòu)明確、候選原料的合成工藝路線簡單、合成產(chǎn)物穩(wěn)定性良好等特點?；谏鲜鲈瓌t，近年來，抗感染藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制了多個單獨或一系列具有質(zhì)控價值的特定雜質(zhì)對照品。

以頭孢唑林鈉品種為例，2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)是頭孢唑林鈉的3位側(cè)鏈，它不僅是頭孢唑林鈉合成時用到的中間體，也是其主要降解產(chǎn)物之一。在對頭孢唑林和雜質(zhì)ADMET的預(yù)測與安全性評估中發(fā)現(xiàn)，頭孢唑林鈉的毒性作用主要與3-位側(cè)鏈的MMTD結(jié)構(gòu)相關(guān)，MMTD的毒性作用較頭孢唑林的毒性強約10倍[9]?；谏鲜鎏攸c，在國內(nèi)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未對MMTD進行控制時，中檢院2010年率先建立了MMTD定量測定用對照品。頭孢唑林鈉主要生產(chǎn)企業(yè)繼而使用該對照品，以MMTD為指針調(diào)整和優(yōu)化生產(chǎn)工藝，修訂內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使頭孢唑林鈉出廠時的主要毒性雜質(zhì)MMTD含量均低于0.1%。中國藥典2010年版開始控制頭孢唑林鈉中的雜質(zhì)MMTD(雜質(zhì)E，限度為1.0%)。2003年的國家藥品抽檢中，國產(chǎn)注射用頭孢唑林鈉中雜質(zhì)E的含量為0.1%～0.6%，較2009年數(shù)據(jù)已經(jīng)有所提高[10]；而2020年國家藥品抽檢結(jié)果顯示，在200余批國產(chǎn)注射用頭孢唑林鈉中雜質(zhì)E基本均為未檢出(未發(fā)表資料)，提示該品種的質(zhì)量得以較大幅度地提高。

藥物生產(chǎn)過程中使用的中間體及試劑等的殘留物也是藥品的雜質(zhì)來源之一。針對毒性殘留物等，也需建立相應(yīng)的特定雜質(zhì)對照品對其加以控制。2-萘酚是頭孢拉定和頭孢氨芐等原料合成過程中常用的沉淀劑。2009年國家藥品抽檢中發(fā)現(xiàn)，213批頭孢氨芐制劑中有187批檢出了2-萘酚，殘留量多為0.01%～0.05%，殘留量在0.05%～0.1%的樣品約占12.7% ，而部分樣品中2-萘酚含量已超過0.1%；168批頭孢拉定膠囊樣品檢出了2-萘酚，占總批數(shù)的44.2%，最大含量為0.00684%；2-萘酚對皮膚、黏膜有強烈的刺激作用，易經(jīng)皮膚吸收，對腎臟有強烈的刺激作用，對機體的免疫系統(tǒng)也有一定的抑制和損傷作用，還能通過胎盤屏障、血腦屏障[11]。藥品中殘留的2-萘酚進入人體存在嚴(yán)重的安全隱患?；诖?，中檢院開始研制2-萘酚定量測定用雜質(zhì)對照品，并推動中國藥典2015年版在頭孢拉定和頭孢氨芐各論項下開始收載2-萘酚檢查，提高了上述品種的質(zhì)控水平。

1.2 系列特定雜質(zhì)對照品

為解決雜質(zhì)對照品等以往都是在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂后才開始研制的被動局面，按質(zhì)量源于設(shè)計的理念，中檢院提出了抗感染藥物先于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研制系列雜質(zhì)對照品的理念，即按抗感染藥物的類別，合成同類不同品種的系列雜質(zhì)對照品，如喹諾酮類和康唑類[12-13]等系列雜質(zhì)對照品。這類特定雜質(zhì)對照品可滿足仿制藥一致性評價和藥品注冊對API雜質(zhì)譜研究的需求，同時也適用于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。

系列特定雜質(zhì)對照品的研制大多需經(jīng)特殊合成和制備，其研制思路可概括為：首先結(jié)合API的結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)工藝、降解規(guī)律等特點，初步確定目標(biāo)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)；再設(shè)計合成路線確定合成工藝；得到目標(biāo)雜質(zhì)后，按要求開展結(jié)構(gòu)確證；并采用質(zhì)量平衡法或其他可靠的方法賦值。此外，還應(yīng)測定雜質(zhì)的校正因子(響應(yīng)因子)，為后續(xù)替代成本較高或穩(wěn)定性不理想的實物對照品做儲備。其主要研制流程見圖1。

圖1 特定雜質(zhì)對照品研制流程Fig.1 Development process of specific impurity reference standards

按上述研制思路，目前我們對抗感染藥物中的喹諾酮類、康唑類[11-12]、磺胺類等共19個品種建立了70個系列雜質(zhì)對照品(見表1)，如伊曲康唑系列雜質(zhì)對照品，包括伊曲康唑A、B、C、D、E、F和G共7個雜質(zhì)對照品，涉及伊曲康唑合成中的副產(chǎn)物、中間體以及降解雜質(zhì)等。

表1 部分系列雜質(zhì)對照品品種Tab.1 Some species of serial impurity reference standards

此類雜質(zhì)對照品的建立，為后續(xù)相關(guān)藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作提供了堅實的基礎(chǔ)。如在進行加替沙星原料及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高時，借助所建立的5個雜質(zhì)對照品，優(yōu)化了液相色譜條件，并選擇能夠有效表征色譜分離情況且易獲得的雜質(zhì)對照品(N-甲基加替沙星、8-羥基加替沙星、8-氟加替沙星和加替沙星N-甲基物)進行系統(tǒng)適用性試驗，較原進口注冊標(biāo)準(zhǔn)采用2-甲基哌嗪加替沙星雜質(zhì)對照品進行分離度考察更具有合理性和可行性。

2 混合雜質(zhì)對照品

制備特定雜質(zhì)對照品，往往需要耗費大量的人力、物力，且可能仍然無法滿意對諸多雜質(zhì)對照品的需求。目前，各國藥典在HPLC有關(guān)物質(zhì)檢測中，采用原位降解技術(shù)對特定雜質(zhì)進行定位，或利用雜質(zhì)與主成分的相對保留時間進行定位是常用的策略。但色譜峰的相對保留時間容易受到不同實驗室、不同色譜柱、不同品牌儀器以及實驗條件等差異的影響。采用原位降解的方式，通常降解制備過程較為繁瑣、產(chǎn)生雜質(zhì)有限且重現(xiàn)性較差。如何有效地對多個雜質(zhì)快速進行定位和歸屬，一直是藥品質(zhì)控中亟待解決的熱點和難點問題[7-8]。利于混合雜質(zhì)對照品進行系統(tǒng)適用性試驗，集對色譜系統(tǒng)有效性的評價/確認、雜質(zhì)的定位于一體，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于解決復(fù)雜實驗體系有關(guān)物質(zhì)分析中雜質(zhì)的定位、方法的確認和轉(zhuǎn)移等問題。我們也在探討建立抗感染藥物混合雜質(zhì)對照品的一般方法[14]。

針對不穩(wěn)定抗生素藥品的特點，我們提出了制備不穩(wěn)定API混合雜質(zhì)對照品及其應(yīng)用的思路，其研制流程見圖2。應(yīng)用時，利用混合雜質(zhì)對照品進行系統(tǒng)適用性試驗，評價色譜系統(tǒng)對各雜質(zhì)的分離情況；利用混合雜質(zhì)對照品中提供的特定雜質(zhì)的色譜保留信息和紫外光譜信息等可對樣品中的特定雜質(zhì)進行定位。為加強混合雜質(zhì)對照品的實用性，在混合雜質(zhì)對照品的說明書中附標(biāo)準(zhǔn)色譜圖譜，并給出獲得該色譜圖時所采用的色譜柱，以便于使用實驗室之間進行比對。目前混合雜質(zhì)對照品的研制主要針對不穩(wěn)定的β-內(nèi)酰胺類抗生素、發(fā)酵和半合成來源的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等。從中國藥典2010年版起，在中國藥典和國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，已有12個抗生素品種收載了系統(tǒng)適用性對照品(表2)。

圖2 混合雜質(zhì)對照品研制流程Fig.2 Development process of mixed impurity reference standards

表2 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中收載的混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品Tab.2 Mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)contained in the national drug standards

β-內(nèi)酰胺類抗生素因其穩(wěn)定性較差，制備混合雜質(zhì)對照品時主要關(guān)注其降解雜質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中需要對重點關(guān)注的已知雜質(zhì)如聚合物雜質(zhì)等進行定位。由于β-內(nèi)酰胺類抗生素實際產(chǎn)品中聚合物類雜質(zhì)采用相對保留時間定位較困難[15]，采用原位降解的方法制備該雜質(zhì)一般需摸索特殊的條件，且常需要放置較長的時間。在制備混合雜質(zhì)對照品時，通常選擇樣品宜發(fā)生聚合反應(yīng)的條件，如阿莫西林(圖3a)、氨芐西林品種混合雜質(zhì)對照品(圖3b)，色譜條件見表3～4，其中的主要聚合物(二聚體、三聚體)色譜峰明顯且易被識別，用該混合雜質(zhì)對照品進行聚合物的定位，增加了檢驗方法的實用性[8]。

表3 阿莫西林混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品色譜條件Tab.3 Chromatographic conditions of amoxicillin mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)

圖3 β-內(nèi)酰胺類品種混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品典型圖譜Fig.3 Typical chromatogram of amoxicillin mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多為發(fā)酵和半合成來源的品種，雜質(zhì)譜復(fù)雜。制備混合雜質(zhì)對照品時主要關(guān)注發(fā)酵過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)、副產(chǎn)物和降解雜質(zhì)。如阿奇霉素混合雜質(zhì)對照品，通過在粗品原料中添加部分專門合成的特定雜質(zhì)而制成(圖4a)；紅霉素混合雜質(zhì)對照品為特定菌株發(fā)酵產(chǎn)生的紅霉素粗品(圖4b)。上述混合雜質(zhì)對照品在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用于系統(tǒng)適用性試驗，色譜條件見表5～6，通過控制難分離色譜峰的分離度，不僅可有效地表征色譜系統(tǒng)的有效性，且可以方便地對特定雜質(zhì)進行定位[16]。

表5 阿奇霉素混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品色譜條件Tab.5 Chromatographic conditions of azithromycin mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)

圖4 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品典型圖譜Fig.4 Typical chromatogram of azithromycin mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)

表4 氨芐西林混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品色譜條件Tab.4 Chromatographic conditions of ampicillin mixed impurity reference standards(or system suitability reference standards)

3 需進一步開展的工作

從保證藥品的安全性和藥品注冊的角度，雜質(zhì)譜研究仍然是當(dāng)前藥品質(zhì)量研究的重點。目前我們已經(jīng)基本確定了通過雜質(zhì)對照品的研制促進藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的策略。但伴隨著對雜質(zhì)譜的全面、深入研究，諸雜質(zhì)的毒性特性等將更加清晰、明確，是簡單地將所有發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)全部列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還是根據(jù)各個雜質(zhì)的特性，針對性地選擇毒性較強、能夠代表工藝或產(chǎn)品穩(wěn)定性的指針性雜質(zhì)納入標(biāo)準(zhǔn)，是雜質(zhì)譜控制面臨的挑戰(zhàn)。從提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效性，提高質(zhì)控效率，降低檢驗成本的角度，后者更具有優(yōu)勢。因而，雜質(zhì)對照品的研制不僅是單純的制備、標(biāo)定工作，而需要融入藥品質(zhì)量控制的全過程。

在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中通過對特定雜質(zhì)的控制保證產(chǎn)品的安全、有效是產(chǎn)品質(zhì)量控制的發(fā)展方向。利用特定雜質(zhì)對照品和混合雜質(zhì)對照品雖然可以解決色譜分析中部分雜質(zhì)定位、定量方面的問題，但對于性質(zhì)不穩(wěn)定或不易獲得的雜質(zhì)，一味強調(diào)利用實物對照品也會給藥品生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的壓力。中國藥典2020年版已在四部通則0512高效液相色譜法中增訂了利用光譜相似度定性和利用質(zhì)譜檢測器定性的一般要求[17]；鑒于此，開展和推進雜質(zhì)對照品的數(shù)字化研究，即將雜質(zhì)的相關(guān)定性和定量信息，如色譜行為、UV、MS、校正因子等形成數(shù)據(jù)庫[18]，用于藥品的雜質(zhì)研究和檢測中，是提高藥品質(zhì)量研究效率和科學(xué)性的有效途徑。

表6 紅霉素混合雜質(zhì)(系統(tǒng)適用性)對照品色譜條件Tab.6 Chromatographic conditions of erythromycin mixed impurity reference standards