肖慧 王婷婷 吳文獲 洪建文，*

(1 廣東省藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗技術重點實驗室，廣州 510180；2 東莞市清溪鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務中心，東莞 523660)

頭孢吡肟為第4代頭孢類抗生素，主要用于治療敏感菌引起的皮膚和骨組織、下呼吸道等感染[1]。目前國內頭孢吡肟原料合成工藝中均使用了AE活性酯(MAEM)[2-3]，AE活性酯生產(chǎn)工藝中使用了二硫化二苯并噻唑原料，其合成工藝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物MBT(2-巰基苯并噻唑)為基因毒性雜質，在2017年WHO IARC(International Agency for Research on Cancer，國際癌癥研究機構)公布的致癌物清單中MBT屬于2A類致癌物[4]。目前該品種各國藥典標準均暫未對該雜質進行特定控制[5-6]，且暫未查詢到國內有關頭孢吡肟中MBT定量測定的文獻報道，為合理控制注射用鹽酸頭孢吡肟中2-巰基苯并噻唑含量，滿足該品種進一步質量控制及監(jiān)管需求，建立了采用HPLC法測定注射用鹽酸頭孢吡肟中MBT(2-巰基苯并噻唑)含量的方法，為該產(chǎn)品相關雜質控制及臨床應用安全性提供保障。

1 儀器與試藥

Agilent 1260與Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Sartorius CP225D電子天平。

2-巰基苯并噻唑對照品(Macklin，Lot＃C10866197，98%)、49批次注射用鹽酸頭孢吡肟制劑(來源：2020年國家藥品抽檢)、色譜純甲醇及乙腈，分析純磷酸二氫鈉及磷酸。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

流動相：50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液(磷酸調pH值至6.25)-甲醇-80%乙腈(60:10:30)；色譜柱：Inertsil ODS-3v(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：320 nm，進樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min。

2.2 溶液的配制

供試品溶液：取本品1瓶，按標示量加50%乙腈溶解并定量稀釋制成每1 mL含頭孢吡肟50 mg的溶液。

對照品溶液a：取2-巰基苯并噻唑對照品約10 mg，置100 mL容量瓶中，加50%乙腈適量溶解，并稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液b：精密量取上述對照品溶液a 1 mL，置50 mL量瓶中，加50%乙腈適量，稀釋至刻度，搖勻。

3 試驗結果

3.1 方法的選擇

3.1.1 色譜條件的選擇

試驗分別考察了10 mmol/L的乙酸銨-甲醇(60:40，V/V)與50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液(磷酸調pH值至6.25)-甲醇-80%乙腈(60:10:30，V/V/V)作為流動相的情況，結果表明采用50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液(磷酸調pH值至6.25)-甲醇-80%乙腈(60:10:30，V/V/V)作為流動相時，供試品溶液中雜質MBT峰與相鄰雜質峰之間的分離度能達到檢測要求，MBT峰的響應更強，且峰型更好，分析時間更短，空白溶劑不干擾雜質檢測，故選用50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液(磷酸調pH值至6.25)-甲醇-80%乙腈水(60:10:30，V/V/V)作為流動相；通過紫外分光光度計和二極管陣列檢測器進行全波長掃描，MBT最大紫外吸收波長在320 nm左右，選擇320 nm為檢測波長。典型圖譜見圖1～2。

圖1 供試品溶液典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of sample solution

3.1.2 提取方法的選擇

MBT在三氯甲烷、丙酮和乙腈等有機溶劑中易溶，在苯中微溶，水中不溶[7]，文獻采用水溶液-三氯甲烷溶劑萃取方式，濃縮提取，測定頭孢噻肟中MBT含量[8]，同時頭孢吡肟在合成工藝中，可通過強酸性條件下，使用二甲苯作為萃取溶劑，降低頭孢吡肟水溶液中MBT殘留量[4]，本次研究嘗試將樣品用0.25 mol/L的鹽酸溶液溶解后，分別采用二甲苯及三氯甲烷作為萃取溶劑，濃縮提取樣品水溶液中MBT，結果顯示：使用二甲苯及三氯甲烷作為萃取溶劑，回收率均低于70%，且二甲苯及三氯甲烷毒性較大；采用“2.2”項下供試品溶液制備方法，將樣品用50%乙腈溶解后直接進樣，回收率較高，約為91.7%，操作簡單快捷，污染風險較低，故試驗選擇采用50%乙腈溶解樣品后直接進樣的提取方法。

3.2 專屬性[9]

圖2 對照品溶液典型色譜圖Fig.2 Typical chromatogram of reference solution

取“2.2”項配制的供試品溶液與對照品溶液b，采用二極管陣列檢測器，按“2.1”項色譜條件，對目標物進行全波長掃描及峰純度檢查，并進行色譜峰匹配。結果表明，供試品溶液中目標物峰“純度角度(11.024)”小于“純度閾值(13.297)”，且“自動閾值曲線”在“純度曲線”之上，說明供試品溶液中檢出目標物峰中基本不含其它混合物；其與對照品溶液b色譜峰匹配結果顯示，兩者的全波長掃描圖譜相同，且“匹配角度(8.494)”小于“匹配閾值(9.320)”，兩者成分一致，均為2-巰基苯并噻唑，該方法專屬性良好。結果見圖3。

圖3 專屬性試驗色譜圖Fig.3 Chromatogram in specificity test

3.3 線性

取“2.2”項下對照品溶液a適量，分別加50%乙腈適量并稀釋制成含2-巰基苯并噻唑約為0.01、0.025、0.05、0.1、0.4、1、2、10、20、50和100 μg/mL的系列溶液，照“2.1”項下方法分別進樣。以2-巰基苯并噻唑濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰響應值為縱坐標，繪制線性曲線，結果顯示，該方法線性良好(線性范圍：0.01～129.2 μg/mL，回歸方程y=70652x-2167.2，相關系數(shù)r=0.9999)。

3.4 回收率試驗

取2.2項下對照品溶液a 5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%乙腈適量，稀釋至刻度，作為回收用對照品儲備液。取含量已知的同批供試品9瓶(規(guī)格：0.5 g)，分別精密加入回收用對照品儲備液0.2、1和2 mL各3份，再加50%乙腈定容至10 mL，搖勻，照“2.1”項下方法進行測定，回收率均值為91.7%，見表1。

表1 回收率結果表Tab.1 Rate of recovery result table

3.5 精密度考察

3.5.1 重復性

取同批供試品6瓶，按“2.2”項下方法配制供試品溶液，照“2.1”項下條件進行分析，MBT含量測定結果見表2，該方法重復性良好。

表2 重復性結果表Tab.2 Table of repeatability results

3.5.2 中間精密度

采用“2.1”和“2.2”項下方法，使用不同品牌的色譜柱(Inertsil ODS-3v與Phenomenex Luna C18)，對同批供試品進行測定，MBT含量結果均為0.2 μg/g，該方法中間精密度良好。

3.6 耐用性考察

采用“2.1”和“2.2”項下方法，分別改變流動相比例、柱溫和流速對同批供試品進行測定，結果表明方法的耐用性良好，結果見表3。

表3 耐用性考察結果Tab.3 Durability investigation results

3.7 檢測限與定量限

取2.2項下對照品溶液b逐級稀釋，以信噪比10:1為定量限，以信噪比3:1為檢出限，該方法定量限為0.3 ng，檢測限為0.1 ng。

3.8 樣品測定

取2020年國家藥品抽檢不同原料來源的49批次樣品，按“2.2”項下方法配制供試品溶液，照“2.1”項下條件測定，按頭孢吡肟標示量計算樣品中的2-巰基苯并噻唑含量，結果見表4。

表4 49批次樣品中2-巰基苯并噻唑含量測定結果表Tab.4 Results of determination of 2-mercaptobenzothiazole in 49 batches of samples

4 討論

頭孢吡肟原料合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物2-巰基苯并噻唑為基因毒性雜質，具有比一般雜質更大的危害性[10]，可能會間接或直接損傷細胞DNA，誘導細胞產(chǎn)生基因突變，導致染色體重排或斷裂，從而產(chǎn)生致突變和致癌作用。本次研究建立的注射用鹽酸頭孢吡肟中MBT含量測定方法，準確、靈敏、耐用性良好，且樣品直接溶解進樣，無需濃縮萃取，較為簡單快捷，可作為注射用鹽酸頭孢吡肟常規(guī)質量控制及監(jiān)督檢驗的有效補充檢測方法，為其安全性控制提供了進一步技術支持。

注射用鹽酸頭孢吡肟為抗感染類注射藥物，其治療周期一般不超過一個月，最大劑量為6 g/d，根據(jù)ICH M7 assessment and control of DNA reactive impurities(DNA基因毒性雜質的ICH M7評估和控制指南)與ChP2020年版四部的遺傳毒性雜質控制指導原則的規(guī)定，按日攝入量120 μg/d計，注射用鹽酸頭孢吡肟中2-巰基苯并噻唑的限度為：20 μg/g。對2020年國家評價性抽檢的不同原料來源49批次樣品測定，結果顯示，49批次國產(chǎn)制劑中均有檢出2-巰基苯并噻唑，但含量均在1.3 μg/g以下，遠低于20 μg/g的推算控制限度，整體安全風險較低。