李佩 李雪 洪建文 田潔

(1 廣東省藥品檢驗所，廣州 510663；2 國家藥品監(jiān)督管理局藥品評價中心，北京 100022)

頭孢尼西鈉(cefonicid sodium)，為第二代廣譜、長效的頭孢類抗生素，通過抑制細菌細胞壁合成產(chǎn)生抗菌活性，對革蘭陽性和陰性菌以及一些厭氧菌均有抗菌作用，對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。臨床上適用于下列敏感菌引起的感染：下呼吸道感染、尿路感染、敗血癥、皮膚軟組織感染、骨和關(guān)節(jié)感染，也可用于手術(shù)預(yù)防感染[1-2]。

本實驗室承擔(dān)了2019年注射用頭孢尼西鈉國家評價性抽驗[3-4]，抽樣共涉及13家生產(chǎn)企業(yè)80批次樣品，通過對制劑的梳理，發(fā)現(xiàn)制劑質(zhì)量受原料質(zhì)量的影響較大，使用同一原料的不同制劑生產(chǎn)企業(yè)，其產(chǎn)品殘留溶劑的種類和量呈現(xiàn)同一趨勢，研究采用氣相色譜的方法[5-6]對原料及制劑中的殘留溶劑進行研究分析，提示企業(yè)應(yīng)根據(jù)其生產(chǎn)工藝來建立個性化的質(zhì)量控制要點，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

氣相色譜儀(Agilent 6890、Thermo Trace1300)，檢測器(氫火焰離子化檢測器)，色譜工作站(Empower、變色龍軟件)，電子天平(Sartorius CP225D，十萬分之一)，毛細管色譜柱(DB-1毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：US4886831H、SUPELCO WAX-10毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：64181-01A)，樣品(2019年國家評價性抽驗樣品以及企業(yè)提供的6批原料樣品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 殘留溶劑的種類和量

照《中國藥典》2020年版二部頭孢尼西鈉殘留溶劑檢測方法對樣品進行檢測[7]，分析不同生產(chǎn)企業(yè)的注射用頭孢尼西鈉殘留溶劑的差異。

2.1.1 色譜條件

以DB-1，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN：US4886831H)為色譜柱，程序升溫，起始溫度為45℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升溫至180℃；載氣為氮氣，流速為3 mL/min；FID進樣口溫度為150℃；檢測器溫度為200℃；頂空平衡溫度為90℃，平衡時間為20 min。

2.1.2 溶液的制備及測定

對照品溶液精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃和二氯甲烷各適量，加水定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.6 mg、乙醇1.0 mg、乙腈0.082 mg、丙酮1.0 mg、乙酸乙酯1.0 mg、四氫呋喃0.144 mg和二氯甲烷0.12 mg的溶液，精密量取5 mL，置頂空瓶中，密封。

供試品溶液精密稱取樣品1.0 g，置頂空瓶中，精密加水5 mL使溶解，密封。

將對照品溶液與供試品溶液，分別頂空進樣，記錄色譜圖。

2.1.3 供試品中殘留溶劑的檢測結(jié)果

按“2.1.1”項下的色譜條件對國評抽樣中的26批制劑以及企業(yè)提供的6批原料進行檢測，檢測出第二類溶劑甲醇和四氫呋喃，第三類溶劑乙醇和丙酮，未檢出第一類溶劑乙腈和二氯甲烷。不同企業(yè)間甲醇和乙醇的殘留水平較為接近，且均在限度范圍內(nèi)；丙酮的量廠家A、B、C高于其他廠家，其主要受原料來源的影響；四氫呋喃僅存在廠家D～M中，廠家A、B、C中不存在，主要也是受原料的影響。通過對不同制劑及原料殘留溶劑的檢測，發(fā)現(xiàn)制劑殘留溶劑的種類和量主要受原料影響，兩家原料企業(yè)均未檢出第一類溶劑，第二類和第三類溶劑均在可控范圍內(nèi)，使用原料企業(yè)B的制劑在殘留溶劑方面質(zhì)量優(yōu)于企業(yè)A。結(jié)果見表1～2和圖1。

圖1 殘留溶劑典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of residual solvent

表1 供試品中殘留溶劑測定結(jié)果Tab.1 The results of residual solvents in samples

2.1.4 需關(guān)注的溶劑

本次檢測除藥典規(guī)定的殘留溶劑種類外，還發(fā)現(xiàn)3個溶劑峰。對3個溶劑進行研究，通過采用對照品定位、氣相質(zhì)譜聯(lián)用等方法對溶劑進行定性。

溶劑峰1為異丙醇，屬中國藥典殘留溶劑項下規(guī)定的第三類溶劑，應(yīng)限制使用，推測原料合成工藝中使用了該溶劑，企業(yè)應(yīng)對其進行控制，可采用中國藥典現(xiàn)有殘留溶劑方法進行檢測控制。

溶劑峰2為異亞丙基丙酮，通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)，并使用異亞丙基丙酮對照品進行定性，其存在于原料企業(yè)B中，含量在0.001%～0.008%之間。典型色譜圖見圖2～3。

圖2 異亞丙基丙酮對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of isopropylidene acetone reference substance

由于在頭孢尼西鈉原料合成過程中未使用該物質(zhì)，推測異亞丙基丙酮殘留可能有以下兩個原因：①原料合成過程中使用了回收再利用的丙酮，該丙酮中含有異亞丙基丙酮，從而導(dǎo)致其殘留在原料中；②合成過程中使用的丙酮與起始物料反應(yīng)產(chǎn)生了該物質(zhì)。異亞丙基丙酮為不飽和酮具有遺傳毒性致癌警示結(jié)構(gòu)(QSAR評估——3類雜質(zhì)：不飽和酮，含有與原料藥有無關(guān)的警示結(jié)構(gòu)，無致突變性數(shù)據(jù))，企業(yè)應(yīng)確保將該溶劑控制在安全閾值以下。

溶劑峰3為2-乙基己酸，原料合成過程中的成鹽劑2-乙基己酸鈉是頭孢尼西酸的成鹽過程中提供鈉離子的載體，反應(yīng)過程中2-乙基己酸鈉轉(zhuǎn)化成2-乙基己酸，2-乙基己酸是一種有害物質(zhì)，對皮膚、黏膜有刺激作用[8]，因此需要對該溶劑的殘留進行控制。

表2 原料中殘留溶劑測定結(jié)果Tab.2 The results of residual solvents in API

2.2 2-乙基己酸檢測方法的建立

為了更好地對2-乙基己酸的殘留量進行控制，在《中國藥典》2-乙基己酸的檢測方法基礎(chǔ)上，建立頭孢尼西鈉中2-乙基己酸檢測方法，并進行了方法驗證。

2.2.1 色譜條件

以SUPELCO WAX-10毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN:64181-01A)為色譜柱，載氣為氮氣，流速為7.0 mL/min，檢測器為FID，檢測器溫度為300℃，柱溫為150℃，進樣口溫度為200℃，進樣體積為1 μL。

2.2.2 溶液的制備及測定

鹽酸溶液：量取33 mL濃鹽酸，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，即得。

圖3 供試品典型色譜圖Fig.3 Typical chromatogram of sample

內(nèi)標溶液：精密稱取3-環(huán)己丙酸約250 mg，置250 mL量瓶中，用環(huán)己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：精密稱取2-乙基己酸對照品75 mg，置50 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取l mL，置離心管中，加33%鹽酸溶液4.0 mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液。

供試品溶液：精密稱取供試品約0.3 g，置離心管中，加33%鹽酸溶液4.0 mL使溶解，精密加入內(nèi)標溶液l mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液。

將對照品溶液與供試品溶液，精密量取1.0 μL，分別進樣，記錄色譜圖。

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密稱取2-乙基己酸對照品適量，制成不同濃度的標準溶液，按“2.2.1”色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果表明2-乙基己酸在濃度0.0501～2.5050 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程y=0.9401x+0.0039，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。

2.2.4 準確度試驗

內(nèi)標溶液：精密稱取3-環(huán)己丙酸約250 mg，置250 mL量瓶中，用環(huán)己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品儲備液制備：精密稱取2-乙基己酸75 mg，置25 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液1、2、3：分別精密量取對照品儲備液2、2.5和3 mL，分別置5 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

取注射用頭孢尼西鈉(批號：068180301)約0.3 g，精密稱定，稱取9份，分別置10 mL離心管中，將9份溶液分別加入33%鹽酸溶液4 mL，精密加入對照品溶液1、2、3各l mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液，測定2-乙基己酸的量。結(jié)果見表3。

表3 2-乙基己酸準確度測定結(jié)果Tab.3 The accuracy results of 2-ethylhexanoic acid

2.2.5 重復(fù)性試驗

照“2.2.2”項下方法配制成供試品溶液6份進行測定。結(jié)果表明，6份供試品中2-乙基己酸含量的RSD為1.6%，符合要求。重復(fù)性結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果Tab.4 The results of repeatability

2.2.6 檢出限和定量限試驗

精密稱取2-乙基己酸對照品，用內(nèi)標溶液逐級稀釋，取各濃度試驗用溶液依次注入氣相色譜儀進行分析。調(diào)節(jié)儀器靈敏度，以信噪比3為檢出限，最低檢出濃度為2.4 μg/mL；信噪比10為定量限，最低定量濃度為4.8 μg/mL。

2.2.7 耐用性試驗

按照“2.2.1”色譜條件，分別調(diào)節(jié)流速為5 mL/min、9 mL/min以及柱溫為140℃、160℃，其他色譜條件保持不變，進行試驗，考察2-乙基己酸以及3-環(huán)己丙酸的出峰時間、分離度及理論塔板數(shù)，結(jié)果表明不同條件下分離度及理論板數(shù)均符合要求，說明該方法耐用性良好。耐用性試驗檢測結(jié)果見表5。

表5 耐用性試驗檢測結(jié)果Tab.5 The results of durability

2.2.8 供試品中2-乙基己酸的檢測結(jié)果

本次驗證中10家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的63批次供試品，均采用上述方法進行檢測，結(jié)果均在限度(0.3%)范圍內(nèi)，且批間穩(wěn)定性較好。檢測結(jié)果見表6。

表6 供試品中2-乙基己酸的檢測結(jié)果Tab.6 The test results of 2-ethylhexanoic acid in samples

3 結(jié)論

按《中國藥典》2020年版頭孢尼西鈉殘留溶劑方法檢測，國內(nèi)產(chǎn)品殘留溶劑控制得比較好，未檢出一類溶劑，其他殘留溶劑的量也控制在較低水平。

本次殘留溶劑檢測中發(fā)現(xiàn)3個需要關(guān)注的溶劑，現(xiàn)有標準未控制，但產(chǎn)品中實際存在，其中2個有一定的毒性，分別為2-乙基己酸和異亞丙基丙酮，需要關(guān)注和控制，研究建立了2-乙基己酸的檢測方法對其進行控制。

通過對注射用頭孢尼西鈉殘留溶劑的質(zhì)量分析，進一步顯示殘留溶劑與原料合成工藝密切相關(guān)，也揭示工藝的變化和穩(wěn)定性，作為藥品安全性指標，《中國藥典》2020年版中對殘留溶劑控制的要求指出，企業(yè)應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝的特點，制定相應(yīng)的限度，使其符合產(chǎn)品規(guī)范、藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)或其他基本的質(zhì)量要求，因此需要企業(yè)根據(jù)自身產(chǎn)品情況制定方法和限度要求，以保證藥品的安全和質(zhì)量。