陳沫 周震宇 程繼業(yè) 沈心 姚玲

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215000)

注射用美羅培南為人工合成的廣譜碳青霉烯類抗生素，其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌及厭氧菌均有良好的抗菌活性，且對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，臨床上多用于多重耐藥菌的感染和重癥感染的治療[1-5]。本品在《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版二部[6]、美國(guó)藥典(USP43)[7]、日本藥局方(JP18)[8]中均被收載。其中，中國(guó)藥典和日本藥局方均對(duì)其原料藥設(shè)有重金屬檢查項(xiàng)。但重金屬檢查法存在靈敏度低、專屬性不足、無(wú)法測(cè)定單個(gè)元素含量和目測(cè)比色有主觀誤差等缺點(diǎn)。

在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，由不同來(lái)源的原輔料、試劑(如催化劑殘留)以及生產(chǎn)設(shè)備等均可引入元素雜質(zhì)。ICH Q3D[9]基于風(fēng)險(xiǎn)管控的原則，對(duì)藥品中元素雜質(zhì)的限度提出了控制和評(píng)價(jià)的要求，將元素雜質(zhì)分為4類(1類、2A類、2B類、3類)，針對(duì)口服、注射和吸入制劑等不同劑型設(shè)立不同的限值(日允許暴露量，PDE)。USP <233>[10]也提出了元素雜質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證的一般要求。因本品為注射劑，考慮到安全性要求更為嚴(yán)格，需建立更靈敏、準(zhǔn)確的分析方法來(lái)監(jiān)測(cè)元素雜質(zhì)水平。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法具有靈敏度高、干擾少、檢出限低且可同時(shí)分析多種金屬元素等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，已在元素雜質(zhì)分析中廣泛應(yīng)用。本文建立ICP-MS方法測(cè)定注射用美羅培南中的13種元素雜質(zhì)的含量，并對(duì)國(guó)家藥品抽驗(yàn)工作中抽檢的11家企業(yè)產(chǎn)品中的元素雜質(zhì)進(jìn)行了比較分析，為藥品質(zhì)量的精準(zhǔn)控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽默飛Xseries2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Millipore超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試劑與試藥

硝酸(UP級(jí))，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；砷(As)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)、鈷(Co)、釩(V)、鎳(Ni)、銠(Rh)、鈀(Pd)、鋰(Li)、銻(Sb)、銅(Cu)、鋅(Zn)單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)；內(nèi)標(biāo)溶液鈹(Be)、鍺(Ge)、銦(In)、鉍(Bi)單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)，均購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；調(diào)諧溶液為鋰(Li)、釔(Y)、鈰(Ce)、鈦(Ti)、鈷(Co)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(Agilent 公司，質(zhì)量濃度為10 μg/mL)。

注射用美羅培南為2021年國(guó)家藥品監(jiān)督抽驗(yàn)樣品，來(lái)自11家生產(chǎn)企業(yè)(企業(yè)A～K)共100批次，其中企業(yè)A為原研生產(chǎn)企業(yè)，B～K為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)。

2 試驗(yàn)條件

射頻功率為1500 W，載氣(高純氬氣)流速為1.05 L/min，冷卻氣流速13 L/min，霧化氣流量1.0 L/min，輔助氣流量為0.8 L/min，泵速30 r/min，霧化室溫度為2℃；數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式，采樣深度為15 mm，樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)為3次，掃描次數(shù)為100次。選取被測(cè)同位素為7Li、51V、59Co、60Ni、65Cu、66Zn、75As、103Rh、105Pd、111Cd、121Sb、202Hg和208Pb，其中7Li以9Be作為內(nèi)標(biāo)，51V、59Co、60Ni、65Cu、66Zn、75As以72Ge作為內(nèi)標(biāo)，103Rh、105Pd、111Cd、121Sb以115In作為內(nèi)標(biāo)，202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)通過(guò)T型三通管在線引入等離子體。

3 溶液制備

3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液1：分別精密量取As、Cd、Pb、Co、V、Ni、Rh、Pd、Sb單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液制成每1 mL分別含As 15 μg、Cd 2 μg、Pb 5 μg、Co 5 μg、V 10 μg、Ni 20 μg、Rh 10 μg、Pd 10 μg、Sb 90 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液2：分別精密量取Li、Cu、Zn單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量及標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液1 50 μL，置15 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，制成每1 mL分別含As 50 ng、Cd 6.666 ng、Pb 16.67 ng、Co 16.67 ng、V 33.33 ng、Ni 66.67 ng、Rh 33.33 ng、Pd 33.33 ng、Sb 300 ng、Li 833.3 ng、Cu 1000 ng、Zn 4333 ng的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2(0℃～5℃密封貯存)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備(臨用新制)

精密量取“3.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液275、125、250、375和500 μL，分別置20 mL量瓶中，以2%硝酸溶液稀釋為不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

Hg標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：精密量取Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成含Hg為0.075、0.125、0.250、0.375和0.500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

3.3 混合內(nèi)標(biāo)溶液的制備

分別精密量取Be、Ge、In和Bi各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取25 μL，置500 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。0℃～5℃密封貯存。

3.4 供試品溶液的制備

取注射用美羅培南1瓶，加2%硝酸使溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻；精密量取125 μL(1.0 g規(guī)格)、250 μL(0.5 g規(guī)格)、500 μL(0.25 g規(guī)格)，置10 mL量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

4 方法學(xué)考察

4.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

取空白溶液(2%硝酸溶液)、混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、Hg標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液適量進(jìn)行ICP-MS進(jìn)樣分析，內(nèi)標(biāo)溶液通過(guò)在線加入的方式，以各目標(biāo)元素濃度X(ng/mL)為自變量，目標(biāo)元素與內(nèi)標(biāo)元素的響應(yīng)比值Y為因變量，進(jìn)行線性回歸(表1)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各元素雜質(zhì)測(cè)定的線性良好(r≥0.9997)。

4.2 檢測(cè)限與定量限

取空白溶液(2%硝酸溶液)適量，連續(xù)測(cè)定11次，計(jì)算各目標(biāo)元素的信號(hào)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以3倍SD與各目標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為檢測(cè)限，以10倍SD與各目標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為檢測(cè)限，結(jié)果見表1。各元素檢測(cè)限為0.000131～0.023898 ng/mL，定量限為0.00044～0.07966 ng/mL，表明方法靈敏度良好。

表1 13種目標(biāo)元素線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限結(jié)果Tab.1 The linearitY，correlation coefficient，LOD and LOQ for 13 elemental impurities

4.3 加樣回收率試驗(yàn)

取批號(hào)2441C的注射用美羅培南樣品9瓶，按“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以限度濃度的80%、100%和120%水平分別加入標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液2和20 ng/mL Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液各100、125和150 μL，每個(gè)濃度平行制備3份樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果如表2所示，表明本方法準(zhǔn)確性良好，符合USP 43<233>要求。

4.4 重復(fù)性與中間精密度

取目標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照“4.3”項(xiàng)下方法配制限度濃度的供試品溶液6份進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2，各目標(biāo)元素的RSD為2.3%～4.6%，表明本方法重復(fù)性良好。在不同時(shí)間由不同的分析人員按“4.3”項(xiàng)下方法同法操作，各目標(biāo)元素的12份測(cè)定結(jié)果的RSD值作為中間精密度結(jié)果。中間精密度RSD為2.9%～5.7%，表明本方法中間精密度良好。

表2 13種目標(biāo)元素的加樣回收率、重復(fù)性以及中間精密度結(jié)果Tab.2 Results of recovery，repeatability and intermediate precision for 13 elemental impurities

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取注射用美羅培南樣品(批號(hào)2441C)3瓶，按“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置24 h后分別測(cè)定，與臨用新制溶液比較，計(jì)算各元素含量，考察溶液穩(wěn)定性。放置24 h后Li、V、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rh、Pd、Cd、Sb、Hg、Pb元素RSD%分別為6.5%、5.1%、6.8%、3.4%、4.9%、2.1%、7.1%、3.1%、5.9%、7.8%、6.3%、8.1%和7.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

5 樣品測(cè)定

本次評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)共抽取到11家企業(yè)的共100批注射用美羅培南樣品，分別按“3.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，計(jì)算元素雜質(zhì)含量，各企業(yè)樣品中目標(biāo)元素雜質(zhì)的絕對(duì)含量以及相對(duì)含量(絕對(duì)含量/限度)結(jié)果見圖1～2，結(jié)果表明11家企業(yè)注射用美羅培南樣品中元素雜質(zhì)的含量均低ICH Q3D[9]限度要求。

圖1 11家企業(yè)注射用美羅培南中目標(biāo)元素的絕對(duì)含量Fig.1 The results of elemental impurities in meropenem injections from 11 manufactures

6 討論

6.1 元素雜質(zhì)選擇

根據(jù)ICH Q3D[9]對(duì)注射劑評(píng)估要求，需要對(duì)分類1的4個(gè)元素、分類2A的3個(gè)元素以及分類3的3個(gè)元素進(jìn)行評(píng)估，其他元素如非有意添加，可不進(jìn)行評(píng)估測(cè)試。根據(jù)前期對(duì)11家生產(chǎn)企業(yè)注射用美羅培南的處方及合成工藝的調(diào)研結(jié)果可知，多家企業(yè)在合成美羅培南原料藥過(guò)程中使用了催化劑銠和鈀碳，同時(shí)鋅在部分廠家的生產(chǎn)工藝中也有使用。因此，本研究選擇了Li、V、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rh、Pd、Cd、Sb、Hg和Pb共13種元素進(jìn)行測(cè)定，以了解不同廠家樣品中的金屬元素雜質(zhì)殘留，為產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供參考。

6.2 樣品處理方法及內(nèi)標(biāo)元素選擇

本品由美羅培南和無(wú)水碳酸鈉按處方比例無(wú)菌分裝制成，且在2%硝酸中極易溶解，故樣品前處理時(shí)優(yōu)先選擇直接溶解的方法。由于本品中的無(wú)水碳酸鈉含量較高(20.2%～26.7%)，高濃度的鈉可導(dǎo)致嚴(yán)重的基體效應(yīng)和電離抑制，在大批量的樣品測(cè)定后，易引起大量固體沉積在采樣錐，產(chǎn)生信號(hào)漂移。故本研究綜合考慮儀器的靈敏度和耐受性等因素，選擇了合適的樣品稀釋倍數(shù)，最終供試品中鈉離子的濃度為35 μg/mL，同時(shí)采用多元素內(nèi)標(biāo)在線加入的方式，有效地消除了基體效應(yīng)的影響。

6.3 樣品結(jié)果分析

根據(jù)ICH[9]規(guī)定由PDE值和日最大給藥量折算限度濃度，測(cè)定結(jié)果表明各企業(yè)注射用美羅培南樣品中的目標(biāo)元素雜質(zhì)含量均低于限度濃度。對(duì)13種元素雜質(zhì)的相對(duì)含量(絕對(duì)含量/限度濃度)(圖2)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，除H企業(yè)外，各企業(yè)樣品中相對(duì)含量最高的元素均為元素Pd。根據(jù)歐洲藥品管理局(EMA)對(duì)金屬催化劑或金屬試劑的殘留量要求，元素Pd被列為第一類，即具有顯著已知的或懷疑的對(duì)人體的致癌性或可能導(dǎo)致人體其他方面顯著毒性的金屬元素[14]。100批次樣品中F企業(yè)的兩批次(200303和200603)樣品和I企業(yè)的兩批次(401201111和401201007)樣品中Pd元素的含量分別為限度濃度的80.0%、61.4%和82.6%、63.4%。企業(yè)D樣品中Rh元素的平均含量約為限度濃度的29.6%，遠(yuǎn)高于其他樣品。提示對(duì)美羅培南原料殘留催化劑的控制應(yīng)引起關(guān)注，采用精準(zhǔn)的元素雜質(zhì)檢測(cè)較寬泛的重金屬檢查更有意義。此外，各企業(yè)樣品中元素雜質(zhì)總量的差異主要為元素Zn含量的差異所致，所有企業(yè)樣品中元素Zn的絕對(duì)含量均占總量的80%以上。雖然產(chǎn)品中Zn元素的含量均遠(yuǎn)低于PDE限度，但Zn具有催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解之功能[15]，對(duì)美羅培南的穩(wěn)定性可能有影響，企業(yè)對(duì)工藝中Zn的控制亦應(yīng)引起關(guān)注。

圖2 11家企業(yè)注射用美羅培南中目標(biāo)元素的相對(duì)含量Fig.2 The results(absolute content/limit)of elemental impurities in meropenem injections from 11 manufacture