陳援援 劉文秀 馬凱華 楊華 馬儷珍

摘 要：為研究乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸成熟過(guò)程中微生物數(shù)量、微生物多樣性及感官品質(zhì)的影響，分別將SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌）復(fù)合型商業(yè)發(fā)酵劑接種到肉餡中，經(jīng)過(guò)12 d的成熟過(guò)程生產(chǎn)發(fā)酵型風(fēng)干腸，3 個(gè)接種組分別用SHI、WBL、PRO表示，以不接種作為對(duì)照組（control check，CK）。分別在成熟0、3、6、9、12 d取樣，測(cè)定乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)變化，對(duì)成熟6、12 d的樣品進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序分析，并對(duì)風(fēng)干腸成品（成熟12 d）進(jìn)行感官評(píng)定。結(jié)果表明：隨著成熟過(guò)程的進(jìn)行，樣品乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)整體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，SHI、WBL組的乳酸菌在肉餡中能夠快速生長(zhǎng)繁殖，WBL組能顯著降低風(fēng)干腸的菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)和假單胞菌數(shù)（P<0.05），有利于提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì);SHI、WBL、PRO組風(fēng)干腸的葡萄球菌數(shù)均顯著高于CK組（P<0.05），這對(duì)風(fēng)干腸的發(fā)色和風(fēng)味的形成有積極影響;微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，風(fēng)干腸在門水平主要有厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，其中厚壁菌門為4 組風(fēng)干腸的優(yōu)勢(shì)菌門，在WBL組中相對(duì)豐度最高，3 個(gè)接種組中乳桿菌屬和漫游球菌屬相對(duì)豐度大于CK組;質(zhì)構(gòu)特性分析和感官評(píng)定結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵劑和復(fù)配發(fā)酵牛骨調(diào)味基料復(fù)合抗氧化劑協(xié)同作用能提高風(fēng)干腸的感官品質(zhì)，WBL組具有風(fēng)干腸特有的風(fēng)味，感官品質(zhì)好。

關(guān)鍵詞：乳酸菌發(fā)酵劑;風(fēng)干腸;菌群結(jié)構(gòu);高通量測(cè)序;感官品質(zhì)

Effects of Inoculating Lactic Acid Bacterial Starter Cultures on the Microbial Flora Dynamic Change and

Sensory Quality of Air-Dried Sausage during the Ripening Process

CHEN Yuanyuan1， LIU Wenxiu1， MA Kaihua1， YANG Hua2， MA Lizhen1，*

（1.College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China;

2.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry， College of Animal Science and

Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to study the effects of lactic acid bacterial （LAB） starter cultures on microbial quantity， microbial diversity and sensory quality during the ripening of air-dried sausage， three commercial mixed-strain starter cultures， namely SHI-59 （Staphylococcus xylose + Pediococcus pentosus + Lactobacillus plantarum）， WBL-45 （Staphylococcus xylose + Staphylococcus carnosus + Lactobacillus sake）， and PRO-MIX5 （Staphylococcus xylose + Lactobacillus sake +

Lactobacillus paraplantarum） were separately inoculated into ground meat and fermented for 12 days to produce air-dried sausage， and non-inoculated sausage was served as the control group. Samples were taken on days 0， 3， 6， 9 and 12 of ripening to determine the changes in LAB count， total viable count （TVC）， Enterobacteriaceae， Pseudomonas and Staphylococcus counts. The samples on days 6 and 12 were analyzed by 16S rDNA high-throughput sequencing， and sensory evaluation was carried out on sausage on day 12. The results showed that LAB count， TVC， the numbers of Enterobacteriaceae， Pseudomonas and Staphylococcus increased first and then decreased with ripening time. SHI and WBL grew and multiplied rapidly in ground meat， and TVC， and the numbers of Enterobacteriaceae and Pseudomonas significantly decreased in the WBL group （P < 0.05）， which was found to be beneficial to improve the safety and quality of air-dried sausage. The number of Staphylococcus in the SHI， WBL and PRO groups was significantly higher than that in the control group （P < 0.05）， and the increase in Staphylococcus was found to have a positive effect on the formation of the color and flavor of sausages. The analysis of microbial diversity showed that air-dried sausages contained mainly Firmicutes， Proteobacteria and Actinomycetes at the phylum level， among which Firmicutes was the dominant phylum for the four groups， and that the relative abundance of Firmicutes was the highest in the WBL group. The relative abundance of Lactobacillus and Vogococcus in the three inoculated groups was higher than that in the control group. The results of texture analysis and sensory evaluation showed that the combination of LAB starter cultures and a blend of fermented bovine bone flavoring and antioxidants （FBFA） could synergistically improve the sensory quality of air-dried sausage. WBL fermented sausage had a unique flavor and good sensory quality.

Keywords： lactic acid bacterial starter culture; air-dried sausage; microbial flora; high-throughput sequencing; sensory quality

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210827-208

中圖分類號(hào)：TS251.51? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2022）02-0001-08

引文格式：

陳援援， 劉文秀， 馬凱華， 等. 接種乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸成熟過(guò)程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化及感官品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2022， 36（2）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210827-208.? ? http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Yuanyuan， LIU Wenxiu， MA Kaihua， et al. Effects of inoculating lactic acid bacterial starter cultures on the microbial flora dynamic change and sensory quality of air-dried sausage during the ripening process[J]. Meat Research， 2022， 36（2）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210827-208.? ? http：//www.rlyj.net.cn

發(fā)酵和干燥是延長(zhǎng)食品保質(zhì)期最古老的方法，肉制品的傳統(tǒng)發(fā)酵依賴于原料肉及當(dāng)?shù)丨h(huán)境中的微生物群落組成。然而，追求質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和特定的有益微生物群落組成的高品質(zhì)風(fēng)干腸產(chǎn)品，則需要采用人工控制發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)[1]。目前，商業(yè)發(fā)酵劑，如植物乳桿菌已經(jīng)取代了發(fā)酵過(guò)程中的天然微生物群落。有益菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸促進(jìn)了肉餡的酸化（pH 4.59～5.94），進(jìn)而起到抑制致病菌和腐敗菌生長(zhǎng)繁殖的效果[2]。發(fā)酵肉微生物群落的動(dòng)態(tài)變化與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)，特定發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的微生物群落組成可作為評(píng)價(jià)發(fā)酵過(guò)程的指標(biāo)[3]。高通量測(cè)序技術(shù)依據(jù)合成測(cè)序的原理，可以同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行平行測(cè)序，使全面分析一個(gè)物種的整個(gè)基因組成為可能，能更真實(shí)反映樣品中的菌群構(gòu)成，因此，也被稱為深度測(cè)序[4-6]。Wang Xiuhui等[7]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)薩拉米香腸、中國(guó)臘腸和煙熏香腸的細(xì)菌群落組成進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)中國(guó)臘腸和煙熏香腸的細(xì)菌群落組成與薩拉米香腸有很大的差異，細(xì)菌多樣性比薩拉米香腸更豐富，在薩拉米香腸中，葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）的操作分類單元最多，占97.45%，腸球菌屬（Enterococcus spp.）占0.03%;中國(guó)干腌香腸和煙熏香腸中含有乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp.）、魏氏桿菌屬（Weissella spp.）、片球菌屬（Pediococcus spp.）和乳酸球菌屬（Lactococcus spp.）等豐富的乳酸菌，但腸球菌屬相對(duì)豐度分別為1.16%和2.99%，高于薩拉米香腸，這表明中式香腸的衛(wèi)生質(zhì)量還有待進(jìn)一步提高，主要原因是由于中式香腸采用自然發(fā)酵而導(dǎo)致微生物群落不易控制。田建軍[8]從內(nèi)蒙古、新疆和西藏地區(qū)采集有代表性的傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)干肉和接種發(fā)酵劑的人工調(diào)控發(fā)酵香腸進(jìn)行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在人工調(diào)控發(fā)酵香腸中，僅有厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)菌群，而自然發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群有厚壁菌門、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等，說(shuō)明人工接種的發(fā)酵香腸安全品質(zhì)高。Xiao Yaqing等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)接種植物乳桿菌R2或接種混合發(fā)酵劑植物乳桿菌R2和木糖葡萄球菌A2生產(chǎn)風(fēng)干腸，可以增強(qiáng)肉餡體系中優(yōu)勢(shì)菌群的競(jìng)爭(zhēng)力，抑制有害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)游離脂肪酸和游離氨基酸的釋放，防止異味和酸敗的形成。Li Chunsheng等[10]研究表明，分別接種戊糖乳桿菌30-7和30-15用于生產(chǎn)發(fā)酵羅非魚(yú)香腸，能顯著提高2 組香腸厚壁菌門的相對(duì)豐度，分別達(dá)94.62%和96.58%，明顯高于自然發(fā)酵組（89.30%）。Zhang Yulong等[11]將彎曲乳桿菌LAB26和戊糖片球菌SWU73571稀釋到107 CFU/mL，按體積比1∶1混合，制成酸肉發(fā)酵劑，生產(chǎn)酸肉。結(jié)果表明，與自然發(fā)酵相比，雙菌發(fā)酵顯著提高了酸肉的游離氨基酸含量，減少大腸菌群數(shù)量，降低亞硝酸鹽、生物胺和丙二醛含量，提高了酸肉的品質(zhì)和安全性。

提高肉制品安全品質(zhì)的方法包括使用天然保鮮劑（如天然香辛料提取物、果蔬提取物、茶多酚提取物、乳酸鏈球菌素和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等）、發(fā)酵技術(shù)和復(fù)配抑菌技術(shù)（多種抑菌劑協(xié)同使用時(shí)往往具有協(xié)同增效的作用，由于抑菌機(jī)理不同會(huì)減少單一防腐劑的使用量）。本研究在前期風(fēng)干腸加工工藝和配料（添加具有防腐和抗氧化作用的外源添加物發(fā)酵牛骨調(diào)味基料和復(fù)合抗氧化劑（fermented bovine bone flavoring-antioxidant blend，F(xiàn)BFA））的基礎(chǔ)上[12-14]，人工接種3 種商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑，以不接種為對(duì)照組（control check，CK），通過(guò)測(cè)定成熟過(guò)程中乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)變化、16S rDNA高通量測(cè)序分析及感官評(píng)定，研究不同商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸微生物特性及感官品質(zhì)的影響，為提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻排酸成熟24 h的豬后腿肉、豬肥膘 天津二商迎賓肉類食品有限公司;食鹽、白砂糖、曲酒、味精、醬油 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)。

茶多酚、迷迭香 豫中生物科技有限公司;VE、異抗壞血酸鈉 蘇州佰億鑫生物科技有限公司;SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌） 意大利薩科公司;人工膠原蛋白腸衣（牛二層皮提取、孔徑30 mm） 神冠控股（集團(tuán)）有限公司;MRS培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile agar，VRBA）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基?青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy有限公司;Climacell恒溫恒濕箱、Friocell 22恒溫恒濕培養(yǎng)箱 艾力特國(guó)際貿(mào)易有限公司;BVBJ-30F真空攪拌機(jī) 浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司;XZ-5L灌腸機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司;CLASS Ⅱ生物安全柜 天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司;TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;JZ-4拍打式無(wú)菌均質(zhì)器 天津歆毅翎科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FBFA的制備

FBFA是由發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）和復(fù)合抗氧化劑（compound antioxidants，CA）復(fù)配而成。FBF的制備參照樊曉盼等[15]的方法，其添加量為肉質(zhì)量的2%，CA的添加量按照熊鳳嬌等[16]的方法，即茶多酚、迷迭香、VE和異抗壞血酸鈉添加量（以原料肉質(zhì)量計(jì)）分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/kg。

1.3.2 風(fēng)干腸的制作

1）腌制：將豬后腿瘦肉剔除筋膜、脂肪后，用絞肉機(jī)絞碎（篩板孔徑8 mm），背膘用切絲機(jī)切成2 cm左右的絲條狀，按照肥瘦比1∶9放入真空攪拌機(jī)中，加入肉總質(zhì)量1.8%的食鹽、0.01%的亞硝酸鈉（事先用少量水溶解）和抗壞血酸鈉0.055%，真空攪拌5 min，取出后放入不銹鋼盆中，緊貼肉表面蓋一層保鮮膜，于0～4 ℃冷庫(kù)中腌制24 h;

2）拌餡：將腌制好的肉再次倒入真空攪拌機(jī)中，依次加入4%糖、1.5%曲酒、0.2%味精、0.3%生抽、10%水，乳酸菌發(fā)酵劑添加量為0.01%（按肉質(zhì)量計(jì)，CK組不加），真空攪拌8 min;

3）灌腸：將制好的肉餡灌入膠原蛋白腸衣中，結(jié)扎（每節(jié)13～15 cm）、排氣;

4）風(fēng)干：將灌制好的肉腸放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中風(fēng)干12 d，恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、相對(duì)濕度和風(fēng)速參數(shù)如表1所示。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)4 組實(shí)驗(yàn)，拌餡時(shí)每組均加入FBFA，CK組不接種，其他3 組（SHI組、WBL組、PRO組）分別接種SHI-59、WBL-45、PRO-MIX5乳酸菌發(fā)酵劑（活菌數(shù)分別為1012、1011、1011 CFU/g），添加量為0.01%。分別在風(fēng)干0、3、6、9、12 d取樣測(cè)定樣品的乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)、葡萄球菌數(shù);分析風(fēng)干6、12 d的微生物多樣性變化;對(duì)風(fēng)干12 d終產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)、葡萄球菌數(shù)測(cè)定

在生物安全柜無(wú)菌操作，稱取10 g樣品放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，倒入90 mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器拍打2 min，制成10 g/100 mL的樣品勻漿液。吸取1 mL樣品勻漿液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，吸取相應(yīng)稀釋梯度的1 mL液體到無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平行，分別倒入MRS培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、VRBA、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基，在35 ℃培養(yǎng)箱中，腸桿菌培養(yǎng)24 h，其余菌培養(yǎng)48 h，對(duì)乳酸菌、菌落總數(shù)、腸桿菌科、假單胞菌、葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4.2 微生物多樣性分析

將4 組風(fēng)干腸成品送到北京奧維森基因科技有限公司，采用擴(kuò)增子測(cè)序方法分析樣品16S rDNA 的V3～V4區(qū)段、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析[17]，擴(kuò)增區(qū)段引物序列為：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG、GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.3.4.3 感官評(píng)定

將風(fēng)干12 d的4 組風(fēng)干腸樣品做好標(biāo)記，放入沸水中煮制15 min，切成約3 mm左右的薄片，隨機(jī)編號(hào)放入樣品盤中，由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)感官培訓(xùn)的10 名人員組成感官評(píng)定小組進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸成熟過(guò)程中微生物變化的影響

小寫(xiě)字母不同，表示相同風(fēng)干時(shí)間、不同處理組之間差異顯著（P<0.05）;大寫(xiě)字母不同，表示同一處理組、不同風(fēng)干時(shí)間差異顯著（P<0.05）。

由圖1A可知，在風(fēng)干0 d時(shí)，SHI組的乳酸菌數(shù)顯著高于CK、WBL、PRO組（P<0.05），說(shuō)明SHI-59的初始活力較高。風(fēng)干3 d時(shí)，4 組風(fēng)干腸的乳酸菌數(shù)達(dá)到7.48～7.53（lg（CFU/g））。大量研究表明，充足的乳酸菌（通常高于7（lg（CFU/g）））有利于在發(fā)酵初期控制肉餡中致病菌、腐敗菌的繁殖，提高發(fā)酵肉制品的安全性[18]。風(fēng)干9 d時(shí)，4 組風(fēng)干腸的乳酸菌數(shù)達(dá)到最大值（7.93～8.73（lg（CFU/g））），其菌數(shù)高低順序依次為WBL組>SHI組>CK組>PRO組，說(shuō)明WBL-45、SHI-59商業(yè)復(fù)合菌能很好地適應(yīng)該肉餡體系并快速生長(zhǎng)繁殖。風(fēng)干12 d（終點(diǎn)）時(shí)，WBL、SHI組的乳酸菌數(shù)分別快速降低至7.91、7.65（lg（CFU/g）），這是因?yàn)镾HI、WBL組的乳酸菌能快速繁殖產(chǎn)生乳酸，使肉餡的pH值降到接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)5.4，肌原纖維蛋白的收縮、變性或降解，肌肉蛋白持水力減弱，使肉餡中的水分散失。由于自由水和可利用碳水化合物的缺乏，不利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖[19]。而CK、PRO組的乳酸菌數(shù)下降緩慢，且與風(fēng)干9 d時(shí)的乳酸菌數(shù)差異不顯著。

由圖1B、C、D可知，CK、SHI、WBL、PRO組的菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)隨風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后緩慢降低的趨勢(shì)。4 組風(fēng)干腸由于接種的乳酸菌種類不同，在風(fēng)干過(guò)程中腐敗微生物變化規(guī)律不同。到風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)，4 組風(fēng)干腸菌落總數(shù)從高到底依次為：PRO組>SHI組>CK組>WBL組，腸桿菌科數(shù)從高到底依次為：SHI組>PRO組>CK組>WBL組，假單胞菌數(shù)從高到低依次為：PRO組>SHI組>CK組>WBL組?？梢钥闯觯琖BL組的菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)顯著低于SHI、PRO和CK組（P<0.05），說(shuō)明接種WBL-45

商業(yè)發(fā)酵劑對(duì)腐敗微生物有較好的抑制作用，有利于提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)。但SHI和PRO組的菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)和假單胞菌數(shù)顯著高于CK組（P<0.05），可能歸因于FBFA與3 種商業(yè)發(fā)酵劑復(fù)配會(huì)不同程度影響發(fā)酵劑菌株的活力和肉餡體系土著微生物間的群體感應(yīng)，此外，接種的SHI-59和WBL-45商業(yè)發(fā)酵劑分別含有2 種乳酸菌，菌株間存在相互競(jìng)爭(zhēng)作用，影響彼此的代謝，進(jìn)而改變?nèi)怵W體系的菌相。另一方面，由于商業(yè)發(fā)酵劑的適宜生長(zhǎng)溫度為30～40 ℃，而本次風(fēng)干工藝完全按照傳統(tǒng)哈爾濱風(fēng)干腸的干制條件，將溫度控制在（25±2） ℃，而25 ℃恰巧是低溫嗜冷菌假單胞菌的最適宜生長(zhǎng)溫度，由于接種的乳酸菌沒(méi)能在短時(shí)間內(nèi)快速生長(zhǎng)繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌，因而對(duì)假單胞菌和腸桿菌科等腐敗微生物的抑制效果不佳;此外CK組具有土著的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌株，它作為典型的微生物發(fā)酵劑能更快地適應(yīng)特殊的內(nèi)部環(huán)境，具有良好的發(fā)酵性能[20]。

由圖1E可知，SHI組的初始葡萄球菌數(shù)顯著高于CK、WBL、PRO組（P<0.05），可能是由于SHI-59中的葡萄球菌能較好適應(yīng)該肉餡體系。在風(fēng)干3 d時(shí)，CK、WBL、PRO組的葡萄球菌數(shù)分別增加到最大值7.40、7.49、7.26（lg（CFU/g）），SHI組在風(fēng)干6 d時(shí)葡萄球菌數(shù)增加到最大值7.25（lg（CFU/g））。隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，4 組風(fēng)干腸的葡萄球菌數(shù)開(kāi)始緩慢降低，風(fēng)干結(jié)束時(shí)（12 d），CK、SHI、WBL組分別降至5.93、6.50、6.08（lg（CFU/g））。PRO組在風(fēng)干9 d時(shí)葡萄球菌數(shù)降到最低的6.38（lg（CFU/g）），到風(fēng)干結(jié)束時(shí)又增加到7.27（lg（CFU/g））。SHI組、WBL組風(fēng)干9 d時(shí)的葡萄球菌數(shù)顯著低于CK組，而乳酸菌數(shù)顯著高于CK組，二者變化趨勢(shì)相反，可能是風(fēng)干9 d時(shí)，SHI、WBL組乳酸菌的酸化能力較強(qiáng)，強(qiáng)酸化體系會(huì)抑制發(fā)酵香腸中pH值敏感的木糖葡萄球菌的生長(zhǎng)[21-23]。到風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)，風(fēng)干腸中的蛋白質(zhì)被乳酸菌分解成堿性的氨基酸、生物胺和小分子風(fēng)味物質(zhì)等，使風(fēng)干腸的pH值升高，進(jìn)而使PRO組的葡萄球菌數(shù)升高。凝固酶陰性葡萄球菌具有發(fā)色和促進(jìn)風(fēng)味形成的作用[24]，風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)接菌組葡萄球菌數(shù)均顯著高于CK組（P<0.05），這可能也是接菌組風(fēng)干腸的紅度值比CK組高的原因。

2.2 乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸成熟過(guò)程中微生物多樣性指數(shù)的影響

由表3可知，所有樣品的覆蓋率均在99%以上，說(shuō)明測(cè)序深度足以達(dá)到細(xì)菌菌群多樣性的分析[25]。與風(fēng)干6 d相比，風(fēng)干12 d時(shí)CK、SHI組的菌群豐富度指數(shù)（Chao1、Observed_species）和菌群多樣性指數(shù)（PD_whole_tree、Shannon、Simpson）呈現(xiàn)降低趨勢(shì);WBL組的Chao1指數(shù)有升高趨勢(shì)，菌群多樣性指數(shù)（PD_whole_tree、Shannon）降低;PRO組的菌群豐富度指數(shù)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，該結(jié)果與圖1的微生物菌落總數(shù)變化趨勢(shì)一致。到風(fēng)干12 d時(shí)，PRO組PD_whole_tree、Shannon指數(shù)明顯高于CK、SHI、WBL組，且4 組風(fēng)干腸的Shannon、Simpson指數(shù)大小關(guān)系為PRO組>SHI組>WBL組>CK組，說(shuō)明接種組的菌群多樣性高于CK組，其中PRO組的菌群多樣性最豐富，細(xì)菌群落組成的變化主要是由原料、發(fā)酵劑種類、發(fā)酵溫度、相對(duì)濕度和工藝環(huán)境的差異引起的[26]，乳酸菌發(fā)酵劑能合成多種代謝產(chǎn)物，這在它們與其他微生物相互作用的背景下是非常重要的，細(xì)菌素和其他抗菌因子的產(chǎn)生，如乳酸的積累，可能是在混合發(fā)酵中獲得穩(wěn)定菌群的良好屏障[27]，它們能殺滅腐敗或致病微生物。

2.3 風(fēng)干腸成熟6、12 d時(shí)基于門水平微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化

由圖2可知，在門水平上鑒定出相對(duì)豐度大于1%的有3 個(gè)門，厚壁菌門是風(fēng)干腸中基于門水平的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度占61%以上，其次是變形菌門和放線菌門（Actinobacteria），這與田建軍[8]研究的接種發(fā)酵劑的人工調(diào)控發(fā)酵香腸鑒定出厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)果一致。Haberman等[28]研究表明，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性的厚壁菌門是人類腸道的優(yōu)勢(shì)有益菌。厚壁菌門是CK、SHI、WBL、PRO組的優(yōu)勢(shì)菌群，風(fēng)干12 d時(shí)4 組風(fēng)干腸厚壁菌門的相對(duì)豐度分別為73.12%、69.41%、77.96%、68.91%，其中WBL組的厚壁菌門相對(duì)豐度最高;風(fēng)干6 d時(shí)，CK、SHI、WBL、PRO組變形菌門的相對(duì)豐度分別為25.72%、31.64%、25.14%、36.62%，到風(fēng)干12 d時(shí)依次降低為24.62%、28.99%、19.93%、29.14%，這可能是受發(fā)酵環(huán)境（低pH值）的影響，在發(fā)酵過(guò)程中一些腐敗微生物被抑制，使細(xì)菌群落豐度持續(xù)降低[29]，變形菌門在WBL組成品中相對(duì)豐度最低，說(shuō)明接種WBL-45商業(yè)復(fù)合菌增強(qiáng)了優(yōu)勢(shì)菌的競(jìng)爭(zhēng)能力，抑制了有害菌變形菌門的生長(zhǎng);放線菌門相對(duì)豐度在CK、SHI、WBL組中隨著風(fēng)干的進(jìn)行呈降低趨勢(shì)，在PRO組中為升高趨勢(shì)，風(fēng)干12 d時(shí)依次為1.10%、0.70%、0.82%、0.87%，放線菌門在CK組相對(duì)豐度最高，其次是PRO、WBL、SHI組，說(shuō)明接種不同的乳酸菌發(fā)酵劑能改變風(fēng)干腸在門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.4 風(fēng)干腸成熟6、12 d時(shí)基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化

風(fēng)干12 d時(shí)，在屬水平上注釋到的物種有186 種，其中相對(duì)豐度大于1%的有15 種，即乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、弧菌屬（Vibrio）、漫游球菌屬（Vagococcus）、發(fā)光細(xì)菌屬（Photobacterium）、變形桿菌屬（Proteus）、腸球菌屬（Enterococcus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、耶爾森氏菌屬（Yersinia）、片球菌屬（Pediococcus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、普羅威登菌屬（Providencia）、巨型球菌屬（Macrococcus）和嗜胨菌屬（Peptoniphilus），如圖3所示。其中弧菌屬、發(fā)光細(xì)菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、耶爾森氏菌屬和普羅威登菌屬為革蘭氏陰性菌，屬于變形菌門，其余9 個(gè)屬為厚壁菌門，大量研究表明變形菌門包括很多腐敗菌[30]。

由圖3可知，與風(fēng)干6 d相比，風(fēng)干12 d時(shí)，變形菌門的6 個(gè)腐敗菌屬的菌群總相對(duì)豐度呈不同程度的降低趨勢(shì)，在4 組風(fēng)干腸中相對(duì)豐度大小依次為：WBL組（14.91%）CK組（70.66%）>SHI組（63.49%）>PRO組（50.19%），可以看出WBL組乳桿菌目微生物相對(duì)豐度為組內(nèi)最大，腐敗微生物屬相對(duì)豐度最小，說(shuō)明WBL-45發(fā)酵劑在該肉餡體系中具有良好的適應(yīng)性，使接種的乳酸菌占微生物區(qū)系的主導(dǎo)地位，能較好地抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，適合與FBFA復(fù)配用于生產(chǎn)風(fēng)干腸。乳球菌屬相對(duì)豐度在4 組風(fēng)干腸中均隨風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，大量研究表明，乳球菌屬具有產(chǎn)生細(xì)菌素的能力，能夠抑制肉制品中許多革蘭氏陽(yáng)性食源性病原體，如梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和鏈球菌[31];在風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)，SHI、WBL和PRO組乳桿菌屬和漫游球菌屬相對(duì)豐度高于CK組，這是因?yàn)镾HI、WBL、PRO 3 組商業(yè)發(fā)酵劑中均含有乳桿菌，特別是PRO-MIX5商業(yè)發(fā)酵劑中含有2 種乳桿菌（清酒乳桿菌和類植物乳桿菌），所以PRO組中乳桿菌屬相對(duì)豐度最大（20.71%）。Wang Xiuhui等[7]在中國(guó)干腌香腸中檢測(cè)到大量的乳桿菌屬，乳桿菌因發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸和醋酸，提高風(fēng)干腸風(fēng)味，在發(fā)酵過(guò)程中起著重要作用[32]。

2.5 風(fēng)干腸感官評(píng)定結(jié)果

由圖4可知，WBL、SHI、PRO組風(fēng)干腸在風(fēng)味、酸敗味、酸味、回味、咀嚼性、顏色、嫩度、總體可接受性方面均優(yōu)于CK組，說(shuō)明接種乳酸菌發(fā)酵劑能提高風(fēng)干腸的感官品質(zhì)，與黃俊逸等[33]的研究結(jié)果一致。大多數(shù)感官評(píng)定員一致認(rèn)為，WBL組具有風(fēng)干腸特有的風(fēng)味、無(wú)酸敗味、酸味適宜、回味較強(qiáng)、咀嚼性好、嫩度佳、具有風(fēng)干腸特有的紅色、整體可接受性高，這可能是接種的乳酸菌和葡萄球菌共同作用的結(jié)果。研究表明，一些乳桿菌屬具有脂解和蛋白水解活性，這有利于香腸風(fēng)味的形成[34-35]。Hu Yingying等[36]研究發(fā)現(xiàn)，混和菌株戊糖片球菌、木糖葡萄球菌、彎曲乳桿菌發(fā)酵的風(fēng)干腸可以提高紅度值和形成更多的醛類、酮類、醇類、酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)。

3 結(jié) 論

研究不同商業(yè)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑與FBFA協(xié)同作用對(duì)風(fēng)干腸微生物及感官品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，隨著風(fēng)干過(guò)程的進(jìn)行，樣品乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，SHI-59、WBL-45商業(yè)復(fù)合菌能較好適應(yīng)肉餡體系，生長(zhǎng)繁殖速度快，到風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)，WBL組能明顯降低風(fēng)干腸的菌落總數(shù)、腸桿菌科數(shù)和假單胞菌數(shù)（P<0.05），提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)，接菌組風(fēng)干腸的葡萄球菌數(shù)顯著高于CK組，這有利于風(fēng)干腸的發(fā)色和風(fēng)味的形成。微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，4 組風(fēng)干腸在門水平的優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門，在WBL組中的相對(duì)豐度最高。SHI、WBL、PRO組中乳桿菌屬和漫游球菌屬相對(duì)豐度大于CK組。感官評(píng)定結(jié)果表明，商業(yè)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑PRO-MIX5、SHI-59、WBL-49與FBFA協(xié)同作用能提高風(fēng)干腸的感官品質(zhì)，WBL組具有風(fēng)干腸特有的風(fēng)味，整體可接受性高。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHAO Lihua， JIN Ye， MA Changwei， et al. Physico-chemical characteristics and free fatty acid composition of dry fermented mutton sausages as affected by the use of various combinations of starter cultures and spices[J]. Meat Science， 2011， 88（4）： 761-766. DOI：10.1016/j.meatsci.2011.03.010.

[2] ARO J M A， NYAM-OSOR P， TSUJI K， et al. The effect of starter cultures on proteolytic changes and amino acid content in fermented sausages[J]. Food Chemistry， 2010， 119（1）： 279-285. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.06.025.

[3] LI Jing， LI Caichan， LI Shengjie， et al. Effects of temperature on microbial succession and quality of sour meat during fermentation[J]. LWT-Food Science and Technology， 2019， 114： 108391. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108391.

[4] LOGARES R， SUNAGAWA S， SALAZAR G， et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alter native to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities[J]. Environmental Microbiology， 2014， 16（9）： 2659-2667. DOI：10.1111/1462-2920.12250.

[5] SULTAN M， SCHULZ M H， RICHARD H， et al. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J]. Science， 2008， 321： 956-960. DOI：10.1126/science.1160342.

[6] L? Xiao， WANG Qian， GE Xueling， et al. Application of high-throughput gene sequencing in lymphoma[J]. Experimental and Molecular Pathology， 2021， 119： 104606. DOI：10.1016/j.yexmp.2021.104606.

[7] WANG Xiuhui， ZHANG Yalin， REN Hongyang， et al. Comparison of bacterial diversity profiles and microbial safety assessment of salami， Chinese dry-cured sausage and Chinese smoked-cured sausage by high-throughput sequencing[J]. LWT-Food Science and Technology， 2018， 90： 108-115. DOI：10.1016/j.lwt.2017.12.011.

[8] 田建軍. 傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中微生物多樣性、功能乳酸菌代謝產(chǎn)物及基因序列分析[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

[9] XIAO Yaqing， LIU Yingnan， CHEN Conggui， et al. Effect of Lactobacillus plantarum and Staphylococcus xylosus on flavour development and bacterial communities in Chinese dry fermented sausages[J]. Food Research International， 2020， 135： 109247. DOI：10.1016/j.foodres.2020.109247.

[10] LI Chunsheng， ZHAO Yue， WANG Yueqi， et al. Microbial community changes induced by Pediococcus pentosaceus improve the physicochemical properties and safety in fermented tilapia sausage[J]. Food Research International， 2021， 147： 110476. DOI：10.1016/j.foodres.2021.110476.

[11] ZHANG Yulong， HU Ping， XIE Yaoyao， et al. Co-fermentation with Lactobacillus curvatus LAB26 and Pediococcus pentosaceus SWU73571 for improving quality and safety of sour meat[J]. Meat Science， 2020， 170： 108240. DOI：10.1016/j.meatsci.2020.108240.

[12] 陳援援， 于德陽(yáng)， 秦建鵬， 等. 外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸微生物群落組成變化的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2021， 42（7）： 145-149. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020090228.

[13] 陳援援， 于德陽(yáng)， 秦建鵬， 等. 外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸風(fēng)味變化的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2021， 42（4）： 215-225; 231. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020040146.

[14] 陳援援， 馬凱華， 李璐， 等. 外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸風(fēng)干過(guò)程中理化性質(zhì)及安全品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（6）： 14-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200214-036.

[15] 樊曉盼， 施煜， 劉一鳴， 等. 天然牛肉調(diào)味基料的增稠工藝優(yōu)化[J].?食品研究與開(kāi)發(fā)， 2019， 40（14）： 81-85. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.14.014.

[16] 熊鳳嬌， 馬儷珍， 王洋. 二次回歸正交設(shè)計(jì)優(yōu)選阻斷NDMA形成的亞硝化抑制劑[J]. 肉類研究， 2018， 32（6）： 29-34. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201806006.

[17] 朱迎春， 王洋， 樊曉盼， 等. 基于宏基因組學(xué)技術(shù)分析不同貯藏條件下鯰魚(yú)片中的菌相變化[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 50（5）： 913-923. DOI：10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.014.

[18] CENCI-GOGA B T， RANUCCI D， MIRAGLIA D， et al. Use of starter cultures of dairy origin in the production of Salame nostrano， an Italy dry-cured sausage[J]. Meat Science， 2008， 78（4）： 381-390. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.07.001.

[19] HU Yingying， ZHANG Lang， ZHANG Hua， et al. Physicochemical properties and flavour profile of fermented dry sausages with a reduction of sodium chloride[J]. LWT-Food Science and Technology， 2020， 124： 109061. DOI：10.1016/j.lwt.2020.109061.

[20] SPERANZA B， BEVILACQUA A， CORBO M R， et al. A possible approac to assess acidification of meat starter cultures： a case study from some wild strains of Lactobacillus plantarum[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2017， 97（9）： 2961-2968. DOI：10.1002/jsfa.8135.

[21] RAVYTS F， STEEN L， GOEMAERE， et al. The application of staphylococci with flavour-generating potential is affected by acidifification in fermented dry sausages[J]. Food Microbiology， 2010， 27（7）： 945-954. DOI：10.1016/j.fm.2010.05.030.

[22] STAVROPOULOU D A， DE MAERE H， BERARDO A， et al. Species pervasiveness within the group of coagulase-negative staphylococci associated with meat fermentation is modulated by pH[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 2232. DOI：10.3389/fmicb.2018.02232.

[23] STAVROPOULOU D A， DE MAERE H， BERARDO A， et al. Pervasiveness of Staphylococcus carnosus over Staphylococcus xylosus is affected by the level of acidifification within a conventional meat starter culture set-up[J]. International Journal of Food Microbiology， 2018， 674： 60-66. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2018.03.006.

[24] SUN Jian， CAO Chenchen， FENG Meiqin， et al. Technological and safety characterization of coagulase-negative staphylococci with high protease activity isolated from traditional Chinese fermented sausages[J]. LWT-Food Science and Technology， 2019， 114： 108371. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108371.

[25] SUN Xiaohui， HONG Hui， JIA Shiliang， et al. Effects of phytic acid and lysozyme on microbial composition and quality of grass carp （Ctenopharyngodon idellus） fillets stored at 4 ℃[J]. Food Microbiology， 2020， 86： 23-32. DOI：10.1016/j.fm.2019.103313.

[26] QUIJADA N M， DE FILIPPIS F， SANZ J J， et al. Different Lactobacillus populations dominate in “Chorizo de León” manufacturing performed in different production plants[J]. Food Microbiology， 2018， 70： 94-102. DOI：10.1016/j.fm.2017.09.009.

[27] GARC?A C， RENDUELES M， D?AZ M. Microbial amensalism in Lactobacillus casei and Pseudomonas taetrolens mixed culture[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering， 2017， 40（7）： 1111-1122. DOI：10.1007/s00449-017-1773-3.

[28] HABERMAN Y， TICKLE T L， DEXHEIMER P J， et al. Pediatric Crohn disease patients exhibit specific ileal transcriptome and microbiome signature[J]. Journal of Clinical Investigation， 2014， 124（38）： 3617-3633. DOI：10.1172/JCI75436.

[29] HU Yingying， WANG Hui， KONG Baohua， et al. The succession and correlation of the bacterial community and flavour characteristics of Harbin dry sausages during fermentation[J]. LWT-Food Science and Technology， 2021， 138（1）： 110689. DOI：10.1016/j.lwt.2020.110689.

[30] 盧烽， 劉鳳嬌， 胡小松， 等. 葡萄多酚改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高血脂及對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2021， 21（7）： 97-106. DOI：10.16429/j.1009-7848.2021.07.012.

[31] 王舒叆， 王子元， 張敏. 不同抑菌劑對(duì)青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的抑制作用[J]. 食品科學(xué)， 2020， 41（13）： 206-211. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20190623-271.

[32] DROSINIS E H， PARAMITHIOTIS S， KOLOVOS G， et al. Phenotypic and technological diversity of lactic acid bacteria and staphylococci isolated from traditionally fermented sausages in Southern Greece[J]. Food Microbiology， 2007， 24（3）： 260-270. DOI：10.1016/j.fm.2006.05.001.

[33] 黃俊逸， 王鳳娜， 吳香， 等. 復(fù)合發(fā)酵劑的篩選及其對(duì)發(fā)酵香腸加工過(guò)程中品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)， 2020， 41（24）： 95-101. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20191023-241.

[34] EDUARDO D， FUNCK G D， HAUBERT L， et al. Selection of native bacterial starter culture in the production of fermented meat sausages： application potential， safety aspects， and emerging technologies[J]. Food Research International， 2019， 122： 371-382. DOI：10.1016/j.foodres.2019.04.018.

[35] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei on volatile compounds of heat treated probiotic dry-fermented sausages[J]. Food Chemistry， 2015， 178：?201-207. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.068.

[36] HU Yingying， CHEN Qian， WEN Rongxin， et al. Quality characteristics and flavor profile of Harbin dry sausages inoculated with lactic acid bacteria and Staphylococcus xylosus[J]. LWT-Food Science and Technology， 2019， 114： 108392. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108392.

收稿日期：2021-08-27

基金項(xiàng)目：“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0401500）

第一作者簡(jiǎn)介：陳援援（1995—）（ORCID： 0000-0002-3601-7117），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿庵破钒踩刂啤?/p>

E-mail： 1041492856@qq.com

通信作者簡(jiǎn)介：馬儷珍（1963—）（ORCID： 0000-0003-2744-7171），女，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。

E-mail： malizhen-6329@163.com