程婷婷，呂楠，陸超，萬凱，沈玥，董紀強，朱敏杰，羅敏娜，尚清*，高華方*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3. 鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院，鄭州 450000)

Joubert綜合征(Joubert syndrome，JBTS，OMIM#213300)是一種罕見的先天性小腦發(fā)育畸形疾病，于1969年由Joubert等[1]學者首次報道。患者的主要臨床表現(xiàn)有小腦蚓部發(fā)育不全或缺如、腦部磁共振影像(MRI)結果顯示“磨牙征”(molar tooth sign，MTS)、肌張力減低、發(fā)育遲緩/智力障礙、動眼神經失用、呼吸節(jié)律異常等，并可累及腎臟、肝臟、視網膜等器官[2-5]。

JBTS是一種典型的單基因遺傳病，主要表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳模式[2，6]。目前，OMIM(online mendelian inheritance in man，https：//www. omim.org)數(shù)據(jù)庫收錄與JBTS表型關聯(lián)的致病基因共39個，這些已知基因的變異能解釋約94%患者的患病原因，其中CPLANE1(C5orf42)、CC2D2A、CEP290、AHI1、TMEM67等是突變頻率最高的JBTS致病基因[2，7-11]。ARMC9是JBTS的致病基因之一，其變異導致的病例大約占所有JBTS患者的1%[12-13]。

本研究采用全外顯子組測序技術對一個JBTS家系的患兒基因組DNA進行檢測，篩選出ARMC9基因(NM_025139.4)上的c.485C>G，p. Ser162*和c.1 878+1G>A變異位點，并對患兒及家系成員進行RT-PCR和Sanger測序驗證，證實ARMC9的復合雜合變異是該家系的致病原因。

材料與方法

一、實驗材料

1.家系來源：該JBTS家系由鄭州大學附屬兒童醫(yī)院(河南省兒童醫(yī)院)康復科采集，包括患兒、同胞姐姐、父親和母親。血樣以及臨床資料的收集均符合知情同意原則。本項研究已通過國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所倫理審查委員會的審查批準(批準文號為201806)。

2.主要試劑：全血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)來自QIAGEN公司(德國)，RNA采血管(TempusTMBlood RNA Tube)、RNA提取試劑盒(TempusTMSpin RNA Isolation Kit)、反轉錄試劑盒(SuperScript IV First-Strand Synthesis System Kit)均來自Thermo Fisher Scientific公司(美國)，Easy Taq DNA酶、Fast Pfu DNA酶以及DNA Marker(DL2000)購自全式金生物技術有限公司，PCR擴增測序引物由北京六合華大科技有限公司合成。

二、DNA提取和全外顯子組測序

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒的操作說明從200 μl全血中提取基因組DNA。用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測DNA濃度。取1 μg DNA用超聲儀(Covaris，美國)隨機打斷成100 bp～200 bp的小片段，使用SureSelect Human All Exon 60M Kit 試劑盒(Agilent，美國)進行建庫，利用NovaSeq6000高通量測序儀(Illumina，美國)進行2×150雙端測序。

三、測序數(shù)據(jù)分析

下機數(shù)據(jù)經質量控制后，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)軟件將數(shù)據(jù)與GRCh37/hg19基因組進行比對，使用GATK(Genome Analysis Toolkit)和VEP(Ensembl Variant Effect Predictor)[14]進行注釋，并參考dbSNP151(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、1000 Genomes Project(http：//browser.1000genomes.org)、Genome Aggregation Database(http：//gnomad.broadinstitute.org/)及The Human Gene Mutation Database(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php/)等數(shù)據(jù)庫。變異位點通過下列步驟進行過濾篩選：(1)優(yōu)先考慮目前已知的JBTS致病基因；(2)保留最小等位基因頻率(MAF)<0.01的變異位點；(3)著重關注無義突變、移碼突變、經典剪切位點突變等致病性強的變異；(4)按照美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院(The American Collage of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南[15]，對篩選后的變異位點進行分級，從而確定候選的致病基因及變異位點。

四、Sanger測序驗證

針對ARMC9基因變異位點所在的外顯子區(qū)域設計上下游引物(引物序列見表1)，以患兒及其父母、姐姐的基因組DNA為模板進行PCR擴增，在ABI 3730xl(Thermo Fisher Scientific，美國)上完成Sanger測序。使用Chromas軟件查看Sanger測序峰圖，SeqMan軟件比對Sanger測序結果。

采用反轉錄PCR(RT-PCR)方法驗證c.1 878+1G>A位點在轉錄水平產生的變化。從全血中提取RNA，逆轉錄成cDNA，用特異性引物(ARMC9in20F、ARMC9in20R)(表1)進行PCR擴增，并進行Sanger測序。

表1 ARMC9基因變異位點擴增引物序列

結 果

一、臨床資料

患兒，男，2月10天，以“不會追視、追聽”為代主訴至鄭州大學附屬兒童醫(yī)院康復科門診就診，現(xiàn)病史：不會抬頭，對視差，不會追視、追聽，易嗆奶，睡眠多。出生史：患兒系第3胎第2產，足月順產，出生體重3.5 kg，出生身長50 cm，出生時有羊水渾濁，無缺氧窒息史，阿氏評分不詳。無特殊家族史。查體：頭圍41.5 cm，右足有六趾畸形，左手小手指根部外側有肉贅(圖1A、B為患兒2歲隨訪時所拍攝)；雙眼瞼下垂，眼球水平震顫；頸軟，心肺腹未見明顯異常，膝腱反射可引出，雙下肢內收肌肌張力略低，雙側巴氏征陽性，雙側踝陣攣陰性。輔助檢查：腦電圖未見異常；肝、腎及泌尿系統(tǒng)B超未見異常。血氨基酸及肉堿檢測未見異常；視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)VEP)異常：雙眼P100波潛伏期輕度延長；顱腦MRI異常：雙側額顳部蛛網膜下腔略寬，左側額部少量硬膜下積液，枕部蛛網膜下腔增寬，小腦蚓部發(fā)育欠佳，雙側小腦上腳長、粗(圖1C)，第四腦室略呈蝙蝠形，腦橋及中腦下部形態(tài)欠規(guī)則，可見“磨牙征”(圖1D)，胼胝體部略薄短。臨床懷疑Joubert綜合征。

A：右足六趾畸形；B：左手小手指根部有肉贅；C：磁共振T1WI矢位示小腦上腳增粗延長；D：磁共振T1WI軸位示“磨牙征”。(箭頭所示為病變位置)。

二、基因變異分析

經全外顯子組測序，分析發(fā)現(xiàn)患兒2號染色體ARMC9基因(NM_025139.4)存在c.485C>G和c.1 878+1G>A復合雜合變異。其中c.485C>G為無義突變，位于第5號外顯子，可導致蛋白質翻譯提前終止，產生截短蛋白(p.Ser162*)；c.1 878+1位于20號外顯子的3’端，屬于經典剪切位點，c.1 878+1G>A變異為經典剪切位點變異。這兩個位點在dbSNP151、1 000 g、gnomAD等公共數(shù)據(jù)庫中未見報道，HGMD數(shù)據(jù)庫未收錄，是新的變異位點。根據(jù)ACMG指南，均屬于致病性變異。ARMC9結構及變異示意圖見圖2。

A：ARMC9蛋白結構域預測簡圖，CC：coiled coil結構域；lc：low complexity；B：ARMC9基因變異，黑色字母表示已報道的變異位點，紅色字母表示本研究發(fā)現(xiàn)的新位點。

三、Sanger測序結果分析

患兒的c.485C>G，p.Ser162*位點來自母親，c.1 878+1G>A位點來自父親，其姐攜帶c.485C>G變異，不攜帶c.1 878+1G>A變異，符合常染色體隱性遺傳的特征(圖3)。

A：家系圖；B：ARMC9變異位點的Sanger測序峰圖(紅色箭頭示變異所在位置)。

為檢測c.1 878+1G>A位點對RNA剪切的影響，分別提取各家系成員的RNA，經反轉錄得到cDNA后，利用ARMC9in20F、ARMC9in20R引物進行PCR擴增(引物序列見表1)。電泳結果顯示父親(Ⅰ：1)與患兒(Ⅱ：3)存在兩個不同長度的擴增條帶，母親(Ⅰ：2)、姐姐(Ⅱ：1)及正常對照(Con)只有單一的擴增條帶。Sanger測序結果證實母親和姐姐只有392 bp的轉錄本，且序列與正常對照一致，而父親與患兒除了392 bp的野生型轉錄本以外，還存在一個287 bp的轉錄本。經比對分析可知該段序列中缺失了20號外顯子的序列。這些結果表明c.1 878+1G>A變異在轉錄水平可造成外顯子跳躍，導致第20號外顯子完全缺失(全長105 bp)(圖4)。

A：cDNA擴增電泳圖；B：正常對照(Con)與患兒(Ⅱ：3)擴增產物的Sanger測序峰圖(紅色箭頭所示為變異起始位置)；C：野生型(WT)和c.1 878+1G>A變異(Mut)所導致的轉錄差異示意圖。

討 論

Joubert綜合征是一種罕見的先天性小腦發(fā)育畸形疾病，有3個關鍵診斷標準：(1)顱腦MRI中顯示“磨牙征”；(2)嬰兒期肌張力減退；(3)發(fā)育遲緩/智力障礙，此外還包括異常眼動、呼吸節(jié)律異常等癥狀[2，5-6，16]。該病例MRI顯示磨牙征、小腦上腳增粗延長、小腦蚓部發(fā)育不良，患兒有肌張力低、發(fā)育落后等癥狀，符合Joubert綜合征的診斷標準。此外，該患兒還有多趾、雙眼瞼下垂、視覺誘發(fā)電位異常等表現(xiàn)。全外顯子組測序及分析結果表明該患兒為1例ARMC9基因變異所導致的Joubert綜合征，其中c.1 878+1G>A變異可導致異常剪切，造成第20號外顯子跳躍。

目前對JBTS的臨床遺傳學研究以國外報道居多，已有至少39個致病基因被發(fā)現(xiàn)[11，17-18]。國內的相關研究較少，在已報道的100余例JBTS中僅少數(shù)病例具有明確的致病基因和變異位點，這些突變分別位于CPLANE1(C5orf42)、CC2D2A、AHI1、MKS1、NPHP1等14個基因上[19-23]。2021年，Luo等[24]在3個中國人群的JBTS家系中發(fā)現(xiàn)了一個新的Joubert綜合征致病基因-IFT74(intraflagellartransportprotein74)，該基因突變的JBTS患者均表現(xiàn)出“磨牙征”、發(fā)育遲緩、多指和輕度唇裂的表型，且所有的4名患者共享c.535C>G變異位點。

本研究中的ARMC9(armadillo repeat containing 9，OMIM#617612)基因，也稱KIAA1868，定位于2q37.1，其編碼的蛋白質存在兩個異構體，長度分別為818個氨基酸和665個氨基酸[12，25]。ARMC9蛋白定位于纖毛的基體，其N端的LisH結構域與微管相連接，在纖毛形成過程中表達上調。ARMC9可以與JBTS相關蛋白CEP104、CSPP1、CEP290、RPGRIP1L、TOGARAM1、CCDC66等發(fā)生相互作用。同時，ARMC9/TOGARAM1復合體可調節(jié)纖毛微管蛋白的翻譯后修飾過程(包括乙?；投嗵腔?、調控纖毛的長度及維持纖毛的穩(wěn)定性[12，18]。

2017年，ARMC9基因變異首次證實與JBTS相關[12]。Van De Weghe等[12]在11名JBTS患者(其中包括6名男性和5名女性，分別來自8個家庭)中發(fā)現(xiàn)了ARMC9基因變異，這些患者具有上瞼下垂(7例)、多趾(2例)、視網膜營養(yǎng)不良(2例)等伴發(fā)癥狀。隨后，Kar等[13]報道了另一個JBTS家系，此家系中的3名患兒均具有“磨牙征”，同時表現(xiàn)出多指(趾)畸形、智力障礙、上瞼下垂的癥狀。全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)了ARMC9基因的同義突變c.879G>A，p.Thr293Thr。Minigene實驗證實該變異在轉錄水平導致了第9號外顯子的跳躍，是該家系的致病原因。2021年初，鄭州大學第三附屬醫(yī)院回顧性分析了11例經產前超聲及MRI診斷為JBTS胎兒的影像學及遺傳學檢測結果。其中，有一例具有“磨牙征”、小腦蚓部完全缺失并伴有右足多趾和單臍動脈的胎兒經遺傳學檢查檢出ARMC9基因的3個雜合變異位點，其中c.879+1G>A遺傳自母親，c.1 369C>T和c.348G>A位點遺傳自父親，但此文未對三個變異位點進行詳細的解讀和致病性分級[26]。

目前HGMD數(shù)據(jù)庫中收錄的ARMC9基因變異共13個，包括7個錯義突變、2個無義突變、3個剪切位點變異和1個大片段缺失(圖2)。這些變異引起的表型多數(shù)與JBTS相關，僅有兩個位點例外，即c.601G>T(p.Glu201*)和c.443T>C(p.Phe148Ser)，它們是在對畸形胎兒的基因篩查中發(fā)現(xiàn)的位點[12-13，27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)的ARMC9基因c.485C>G和c.1 878+1G>A復合雜合變異均未見報道或收錄，是新的變異位點。

目前，Joubert綜合征的致病機理尚不明確，亦無有效的治療措施，對高風險家庭進行產前診斷是預防Joubert綜合征患兒出生的最有效方法。本項研究所發(fā)現(xiàn)的ARMC9基因c.485C>G，p.Ser162*和c.1 878+1G>A變異，明確了該Joubert綜合征家系的致病原因，拓寬了ARMC9基因的變異譜，為該家庭的遺傳咨詢和再生育提供了分子遺傳學基礎。