李彥奇，趙瓊珍，劉金瑞，黃衛(wèi)東，2*

(1.新疆碳智干細胞庫有限公司，圖木舒克 844000；2.新疆佳音醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

體外受精(IVF)技術使女性輸卵管損傷、排卵失敗或男性因素不育的多數(shù)夫婦獲得妊娠，但臨床上仍然存在部分夫婦在IVF周期中出現(xiàn)完全受精失敗(TFF)的情況。TFF是指在一個周期中所有卵母細胞的受精失敗。據(jù)報道，在正常精子存在的情況下，IVF后TFF的發(fā)生率為4%～16%[1]。目前，普遍認為卵母細胞活化失敗(OAF)似乎是導致TFF的主要原因[2]。勒布原理指出精子在受精、促進細胞分裂和父系遺傳方面具有重要作用[3]，按照勒布的說法，精子的第二個作用是其特異性蛋白和因子觸發(fā)Ca+2振蕩激活卵母細胞，而且精子中心粒引導卵母細胞和精子核形成合子核[4]。這些研究結果表明，精子在卵母細胞活化、受精卵形成方面都具有積極作用。雖然目前關于TFF的研究主要集中在男性因素，但女性因素也不容忽視。排除卵母細胞儲備減少的周期，TFF率為1%～5%[5]。卵胞質內異常的紡錘體及微管結構會導致染色質異常模式的發(fā)生而影響受精過程[6]。卵母細胞中異常線粒體或三磷酸肌醇(IP3)信號通路導致Ca2+振蕩異常，使激酶/磷酸化酶信號通路異常，皮質反應異常，導致受精失敗[7]。TFF的遺傳原因是未知的，也可能是多種因素造成的，雖然通常歸因于精子因素，也極有可能是卵母細胞異常在其中起到關鍵作用。因此，本研究旨在通過對IVF周期中經歷TFF的夫婦進行全外顯子測序，鑒定篩選與TFF相關的候選基因，并分析其功能，以期為進一步研究其作用機制奠定基礎。

材料與方法

一、研究對象

選取2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院的IVF助孕患者，將IVF后出現(xiàn)TFF的夫婦作為實驗組，納入標準：(1)女性年齡≤40歲；(2)染色體核型正常(46，XN)；(3)輔助生殖治療中，女性獲卵數(shù)>4個/周期；(4)周期中所有卵母細胞均受精失?。?5)排除ICSI及補救ICSI。對照組選擇行IVF后至少生育一個正常孩子的夫婦，納入標準：同實驗組(1)、(2)、(3)；(4)助孕周期中未見異常受精情況。參照WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊，納入研究的所有男性精液常規(guī)檢查結果均正常。

根據(jù)納入標準，實驗組共有64對夫婦，對照組共157對夫婦。本研究已通過倫理審查會批準(JKLL-KY20201221-01)，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.精液常規(guī)檢測：患者手淫取精，充分液化后參照WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊標準，進行精液常規(guī)分析。

2.全外顯子測序及基因注釋：采集實驗組64對夫婦和對照組157對夫婦的外周血 5 ml，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺進行全外顯子組基因測序檢測，AdapterRemoval軟件對測序結果進行處理，使用bwa軟件將數(shù)據(jù)與人類標準參考序列hg19版本比對，經去除重復讀長后，再采用sentieon軟件的Haplotyper算法進行SNP檢測，最后使用GATK的VariantFiltration進行過濾，生成可用于后續(xù)分析的vcf文件。同時對目標區(qū)域的覆蓋度及測序質量進行評估。將所有的SNP與dbSNP以及千人基因組數(shù)據(jù)庫進行基因注釋。

3.變異基因的篩選及驗證：使用“overlap”法篩選基因突變，該突變僅存在于實驗組中，而對照組中不存在，顯著縮小研究范圍。隨后利用OMIM(https：//www.omim.org/)、The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)、Pubmed(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和GeneCards(http：//www.genecards.org/)等公共數(shù)據(jù)庫，對IVF 中TFF的顯著性差異基因位點進行篩選和功能驗證。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、基礎資料比較

本研究共納入實驗組64對夫婦，對照組157對夫婦。統(tǒng)計結果顯示，兩組患者在女性平均年齡、獲卵數(shù)、男性平均年齡、精子濃度及精子活力的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 基礎資料比較(-±s)

二、兩組患者的差異突變基因分布情況

根據(jù)不同組別的SNP位點的突變頻率的不同，使用chisq.test(data)命令進行卡方檢驗(chi-square test)，選擇P<0.05的位點，在女性和男性群體中分別篩選到812和823個顯著性位點，分別位于606和611個基因上。其中，非同義突變最多，終止變異最少，所有變異皆位于常染色體(表2)。

表2 基因變異分布情況

三、兩組患者的顯著性基因頻率統(tǒng)計

采用“overlap”法，分析實驗組中含有、但對照組沒有的變異位點，同時剔除同義突變。在實驗組女性中獲得148個顯著基因共164個突變位點，在實驗組男性中獲得120個顯著基因共132個突變位點。

經數(shù)據(jù)庫篩選，將磷酯酶Cγ1(PLCG1)、驅動蛋白家族成員2B(KIF2B)和驅動蛋白家族成員4B(KIF4B)基因作為TFF的候選基因。其中基因PLCG1的rs2228246位點突變屬于雜合突變，實驗組中有4人攜帶變異，突變率為6.15%(4/64)，實驗組和對照組存在顯著性差異(P<0.05)；在男性實驗組和對照組群體中，基因KIF2B的rs76337756位點和KIF4B的rs10056252位點也屬于雜合突變，分別有3人攜帶，突變率為4.61%(3/64)，且在實驗組和對照組中均存在顯著差異(P<0.05)(表3)。

表3 顯著性基因頻率統(tǒng)計(部分)

四、候選基因的功能分析及驗證

經GeneCards(http：//www.genecards.org/)和The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)分析工具對PLCG1、KIF2B和KIF4B基因功能進行驗證。PLCG1與IP3 的產生有關，IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細胞內Ca+2釋放。PLCG1基因在子宮、子宮內膜、宮頸組織中高表達，在管周細胞、內皮細胞中高度表達(圖1)。KIF2B基因的突變將導致有絲分裂進展延遲，出現(xiàn)單極或無序紡錘體，以及雙核或死細胞數(shù)量增加。KIF2B基因在睪丸、精母細胞中高度表達，其他組織及細胞中沒有表達(圖2)。KIF4B基因在后期紡錘體動力學和胞質分裂、有絲分裂期間染色體分離中起作用；還可能在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中發(fā)揮作用。KIF4B基因在睪丸組織、精母細胞中高度表達，其他組織及細胞中表達較低(圖3)。

A：細胞表達特異性；B：組織表達特異性(來源https：//www.proteinatlas.org/)

A：細胞表達特異性；B：組織表達特異性(來源：https：//www.proteinatlas.org/)

A：細胞表達特異性；B：組織表達特異性(來源：https：//www.proteinatlas.org/)

討 論

全外顯子組只占整個人類基因組的1%～2%，但其中對人類疾病有影響的基因突變有85%[8]。全外顯子組測序可以針對基因組中的蛋白質編碼區(qū)靶向富集外顯子區(qū)域測序。本研究中發(fā)現(xiàn)了4例在IVF周期中發(fā)生PLCG1基因雜合突變的TFF女性患者，在男性群體中發(fā)現(xiàn)了3例KIF2B和3例KIF4B基因突變的TFF患者，這三個基因突變均沒有在對照組中發(fā)現(xiàn)。因此，這3個候選基因突變可能是IVF 中TFF的致病突變位點。

TFF的原因非常復雜[9]。受精過程涉及一系列連續(xù)的步驟，從精子和卵母細胞膜的識別和融合開始，隨后觸發(fā)持續(xù)的胞質鈣(Ca+2) 振蕩，這是刺激胚胎發(fā)育所必需的，Ca+2振蕩數(shù)小時的持續(xù)是卵母細胞活化的常見信號，并開始復雜的發(fā)育過程以形成受精卵[10]。

經過GeneCards數(shù)據(jù)庫的基因功能驗證，PLCG1基因位于20號染色體的長臂上，與IP3 的產生有關，而IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細胞內Ca+2釋放。PLCG1基因編碼蛋白在子宮內膜、子宮、宮頸等女性生殖部位有較高表達。該基因編碼蛋白與精子卵母細胞磷脂酶C zeta 1(PLCZ1)同屬磷脂酶C(PLC)家族，該家族成員均具有保守性的C2結構域、EF結構域、PH結構域[11]。大量研究表明，PLCZ1通過IP3途徑參與卵母細胞激活和原核形成，對受精后卵細胞狀態(tài)的激活至關重要[12]。有證據(jù)表明，PLCZ1在胚胎發(fā)育中具有潛在的作用，尤其是在胚胎早期分裂過程中[13]。研究顯示，女性生殖道環(huán)境對精子運輸和受精過程中也具有重要作用[14]。因此，PLCG1基因可能參與女性受精過程中的機制調節(jié)，該基因的突變可能導致受精的失敗。

KIF2B基因位于17號染色體的長臂上，屬于驅動蛋白家族成員，編碼微管運動蛋白，其特征在于驅動蛋白結構域位于多肽中間。KIF2B基因促進微管運動，活躍在中心體上，參與雙極紡錘體組裝、胞質分裂和染色體運動等多個有絲分裂過程中的關鍵事件。KIF2B基因編碼蛋白在睪丸、精母細胞中高度表達，其他組織及細胞中均沒有表達。KIF4B基因位于5號染色體的長臂上，也屬于驅動蛋白家族成員。該基因參與ATP依賴性微管運動活動、有絲分裂胞質分裂、有絲分裂紡錘體中區(qū)組裝等，在后期紡錘體動力學和胞質分裂中起著至關重要的作用，而且在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中也發(fā)揮作用。KIF4B基因編碼蛋白在睪丸組織、精母細胞中高度表達，其他組織及細胞中表達較低。鞭毛是精子的尾巴，是雄性生育和有性繁殖的重要條件，它含有許多由微管蛋白組成的小管。鞭毛必須要以非常精準和協(xié)調的方式跳動，才能使精子逐步游動，否則，則導致男性不育。有研究顯示，微管蛋白糖基化的酶修飾是讓精子保持直線游動的關鍵[15]。中心體參與胞內細胞骨架的形成、有絲分裂紡錘體的形成等許多功能。在一些畸形精子患者中，精子中心體功能表現(xiàn)出受損的情況使得受精產生障礙[16]。精子中心體對于鞭毛的發(fā)生起著至關重要的作用。在鞭毛的形成中，中心體遷移到細胞外圍，以中心粒為基體啟動軸絲的組裝[17]，中心粒功能障礙也會導致精子尾部鞭毛的缺失[18]。目前關于KIF2B基因的研究發(fā)現(xiàn)，其與腦蛋白疏松癥[19]、肺腺瘤[20]有關；KIF4B基因與肝細胞癌[21]、胰腺癌[22]等疾病有關，在人類受精的研究中都未見報道?；谝陨戏治?，推測KIF2B和KIF4B基因可能參與精子鞭毛的形成及運動，但其具體功能還需進一步研究。

本研究全外顯子測序技術篩選到與TFF相關的PLCG1、KIF2B和KIF4B這3個基因，通過生物信息方法初步分析了基因功能，但這3個基因在TFF發(fā)生過程中的確切作用及其機制還需進一步探索。