朱為民，沈 秀，徐宇嘯

(浙江省臺州醫(yī)院/臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)恩澤醫(yī)院 1.急診科； 2.急診外科；3.病理科，浙江 臺州 318000)

心肌急性缺血發(fā)生后，應對組織灌注進行及時恢復治療，但再灌注本身能進一步加劇心肌損傷的受損程度，即引發(fā)心肌缺血再灌注(I/R)損傷。相關(guān)文獻報道微小RNA(miRNA)作為一類約20個核苷酸的非編碼RNA，其在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫及心血管等疾病中均存在一定的調(diào)控作用。既往報道m(xù)iR-204參與了癌癥、眼科及高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展，而miR-204對I/R損傷機制的研究在國內(nèi)尚未報道。通過生物信息學網(wǎng)站預測，2是miR-204其中的一個靶基因，有研究發(fā)現(xiàn)2可通過JAK-STAT通路對IGF-1的表達產(chǎn)生抑制作用，進而加劇糖尿病I/R損傷。鑒于此，本研究擬在建立I/R損傷模型基礎上，探討miR-204是否通過抑制SOCS2表達對小鼠I/R損傷作用機制產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 50只C57BL/6小鼠購自南京君科生物工程有限公司，每只體質(zhì)量20～30 g，10～12 周齡。自由進食飲水，適應喂養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級，濕度維持在55%～60%，室溫22℃～25℃，正常晝夜節(jié)律。先選用10只小鼠，構(gòu)建心肌缺血再灌注模型并進行鑒定，之后隨機選擇30只小鼠按鑒定成功的建模方法進行后續(xù)實驗。本實驗經(jīng)本院動物倫理協(xié)會批準審核，受到動物倫理協(xié)會的監(jiān)督。

1.2 I/R小鼠模型構(gòu)建建模前，10只小鼠禁食8 h，采用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠；取仰臥位，消毒后切開小鼠頸前區(qū)皮膚，分離組織、肌肉，充分暴露氣管；氣管插管，連接呼吸機；在小鼠第5肋間隙表皮左側(cè)做縱向切口，約2 cm，接著逐層對胸大、小肌進行分離，刺穿暴露的第四肋間隙，向左側(cè)穿破縱膈，將心臟擠出。在左心耳下緣 0.5 cm處，通過 6-0 縫合線對左冠狀動脈進行結(jié)扎。建模成功的判斷標準：當缺血時局部心肌組織蒼白，心電圖監(jiān)測提示ST段抬高，則表明結(jié)扎成功；半小時后，將活結(jié)松開且重新計時，若5 min內(nèi)ST 段恢復或與之前波形存在明顯區(qū)別，則再灌注成功。之后將心臟置于胸腔，排氣胸，縫合皮膚。假手術(shù)組(Sham，10只)采用同樣的開胸方式，但不結(jié)扎左冠狀動脈。

1.3 實驗動物分組與處理 余30只小鼠分為I/R組、mimics-NC組、miR-204 mimics組，每組10只。mimics-NC組、miR-204 mimics組小鼠在建模前48 h將100 uL mimics-NC、miR-204 mimics預先與Lipofectamine 2000混合分別注射至小鼠心肌內(nèi)。實驗結(jié)束后進行后續(xù)指標檢測。

1.4 主要試劑 戊巴比妥鈉溶液購自Sigma公司；Lipofectamine 2000及RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；mimics-NC及miR-204 mimics均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，ELISA試劑盒購自貝克曼庫爾特公司；Masson染色試劑盒購自Service Biological Technology公司；PrimeScript RT試劑盒及SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒購自寶生物工程有限公司；ABI PRISM7300系統(tǒng)購自美國ABI 公司；BCA試劑盒購自AmyJet Scientific公司；SOCS2一抗購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自Abcam公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。引物序列：miR-204，上游：5’ GCCAGATCTGGAAGAAGATGTGGTGGGTTAGT 3’，下游：5’ GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA 3’；U6，上游5’CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3’，下游5’ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3’；SOCS2 ，上游：5’ AGCAGTTTGACAGCGTGGTT 3’，下游：5’ CAGGTAAAGGTGAACAGTCCC 3’；β-actin ，上游：5’ CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3’，下游：5’ TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3’。

1.5 實驗室檢測

1.5.1 血清因子 取小鼠腹主動脈血5 mL，3 000 r/min離心，取上清，參照ELISA試劑盒(貝克曼庫爾特公司，加州，美國)說明書操作步驟測定腦鈉肽(BNP)、心肌肌鈣蛋白( CTn-I)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細胞介素-1β( IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)，采用日立全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。對比各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)及炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)水平。

1.5.2 心肌組織形態(tài)學觀察 實驗結(jié)束后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,立即取出心臟，沖洗殘血至心室腔無血液流出，對去除心室及心房的心臟組織進行沖洗，一部分心肌組織在4%多聚甲醛溶液中固定，一部分組織保存于-80℃。

取置于4%多聚甲醛中固定24 h后的心臟組織，截取心肌組織，做0.3 cm厚的切片，將左室分為6片。常規(guī)石蠟包埋切片,做6 μm厚的薄片，置于45℃恒溫箱中烘干。蘇木精染色3 min，于1%的鹽酸乙醇中2 s，1%氨水返藍，伊紅染色3 min，脫水至透明，中性樹脂封片，干燥72 h，于光學顯微鏡下對心肌組織形態(tài)學進行觀察。

取置于4%多聚甲醛中的心肌組織，常規(guī)切片，脫蠟。在不同酒精梯度中進行浸泡，Masson染色，觀察心肌組織纖維化程度，光鏡下觀察，每張切片選取5個視野進行觀察拍照。

1.5.3 miR-204、2 mRNA測定 通過qRT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中miR-204、2 mRNA的表達，通過RNA提取試劑盒提取心肌組織中總RNA。通過PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL。通過SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒及ABI PRISM7300系統(tǒng)進行熒光定量PCR。反應條件：95℃ 10 min(95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)循環(huán)40次。數(shù)據(jù)予以2法計算目的基因的表達。其中U6是miR-204的擴增內(nèi)參，β-actin是2 、TNF-a、IL-1β、IL-6的擴增內(nèi)參。

1.5.4 SOCS2 蛋白測定 采用Western blot實驗測定心肌組織中SOCS2 蛋白表達水平。取心肌組織，經(jīng)RIPA裂解液裂解，研磨后離心取上清，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。將提取的總蛋白與上樣緩沖液混合，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離蛋白，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，室溫下磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入相應的羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育l h，洗滌，化學發(fā)光試劑顯影，蛋白印記圖像用ImageJ2x軟件分析。

1.5.5 熒光素酶活性檢測 采用生物信息學軟件http://starbase.sysu.edu.cn/預測miR-204和2的靶向關(guān)系。合成含miR-204結(jié)合位點的2 3’UTR啟動子區(qū)序列，構(gòu)建2 3’UTR野生型(WT)質(zhì)粒(2-WT)。并在該質(zhì)?；A上，突變結(jié)合位點，按質(zhì)粒提取試劑盒方法構(gòu)建2 3’UTR 突變型(MUT)質(zhì)粒(2-MUT)。將2-WT、2-MUT質(zhì)粒分別和mimics NC、miR-204 mimics質(zhì)?；靹蚝蠊厕D(zhuǎn)染于HEK293細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2表達情況 各組小鼠的miR-204、SOCS2表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)，見表1及圖1。所有I/R小鼠的miR-204表達均低于Sham組，而2 mRNA及其蛋白表達高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)。I/R組與mimics-NC組之間miR-204、2表達情況差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)，miR-204 mimics組的miR-204表達高于mimics-NC組，2 mRNA及蛋白表達低于mimics-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

圖1 各組心肌組織中SOCS2蛋白的表達Figure 1 SOCS2 protein expression in myocardial tissues of each group

表1 各組小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2 表達的比較Table 1 Comparison of miR-204 and SOCS2 expression in myocardial tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠血清中心肌損傷標志物的比較 各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)的表達情況比較，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)，見表2。所有I/R小鼠的心肌損傷因子表達水平均高于Sham組， mimics-NC組的心肌損傷因子水平均高于miR-204 mimics組，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的心肌損傷因子水平比較無顯著性差異(>0.05)。

表2 各組小鼠血清中心肌損傷標志物的比較Table 2 Comparison of myocardial injury markers in serum of each group of

2.3 各組小鼠心肌組織病理學形態(tài)的比較 HE染色結(jié)果顯示：Sham組心肌組織染色均勻，心肌纖維排列整齊，心肌細胞結(jié)構(gòu)正常，無病理變化；I/R組、mimics-NC組心肌纖維排列紊亂，正常的心肌結(jié)構(gòu)遭到破壞，梗死病灶存在大量炎性細胞的浸潤，心肌細胞較為腫脹，且存在瘢痕組織；miR-204 mimics組心肌纖維結(jié)構(gòu)的受損及炎性細胞的浸潤程度有所減輕，見圖2。

Masson染色結(jié)果顯示：Sham組心肌組織纖維排列整齊，著色均勻，未存在膠原成分；I/R組、mimics-NC組藍色區(qū)域增多，說明膠原成分增加，心肌纖維化程度明顯，且心肌細胞明顯減少；miR-204 mimics組心肌纖維化程度減輕，見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織鏡下觀(HE×200，Masson×200)Figure 2 Microscopic view of myocardial tissue of mice in each group (HE×200, Masson×200)

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子的比較 各組的炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)，見表3。所有I/R小鼠的炎癥因子表達水平高于Sham組，mimics-NC組的炎癥因子表達水平高于miR-204 mimics組，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的炎癥因子水平差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)。

表3 各組小鼠血清中炎癥因子的比較Table 3 Comparison of serum inflammatory factors in each group of mice pg/mL)

2.5 miR-204與SOCS2的關(guān)系 通過Targetscan預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-204可以結(jié)合SOCS2，見圖3a。熒光素酶活性實驗結(jié)果顯示：SOCS2-WT和miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，細胞的相對熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)；而SOCS2-MUT和miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染后，細胞的相對熒光素酶活性無明顯變化(>0.05)，見圖3b。

a. Targetscan網(wǎng)站預測miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系；b.雙熒光素酶驗證miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系。圖3 Targetscan網(wǎng)站預測miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系Figure 3 Prediction of targeting relationship between miR-204 and SOCS2 by Targetscan website

3 討論

miRNA屬于一類長度約為21 nt的RNA，可通過調(diào)控靶基因在機體的病理反應過程中發(fā)揮重要作用。其中有研究報道m(xù)iR-204多與癌癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)miR-204在癌組織中常呈低表達水平，而在癌旁組織中呈高表達水平，對癌細胞的侵襲遷移具有抑制作用，并促進癌細胞的凋亡。還有研究認為miR-204對心血管疾病的發(fā)生也具有一定的調(diào)控作用，Yu等研究發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA AK139328可顯著增加miR-204-3p的表達，抑制心肌細胞自噬，對糖尿病型I/R具有緩解作用。

SOCS家族是一類新型的小分子量多肽，近年來研究報道SOCS與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)。2屬于SOCS家族中的一員，其可作為調(diào)控糖尿病I/R損傷的關(guān)鍵基因，且可通過 JAK-STAT 通路沉默IGF-1的表達進而加重糖尿病I/R損傷。然而近些年來關(guān)于miR-204調(diào)控2參與I/R的作用機制研究尚未見報道。鑒于此，本實驗探究了上調(diào)miR-204表達水平對小鼠心肌組織中SOCS2的表達情況，結(jié)果顯示，miR-204在I/R模型小鼠中呈低表達，在健康小鼠中呈高表達，而2與其表達趨勢恰好相反，且上調(diào)I/R小鼠中miR-204的表達可顯著抑制其SOCS2的表達水平。提示miR-204可能通過抑制SOCS2的表達對小鼠I/R的病理機制發(fā)揮作用。具體作用原因有待進一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，所有I/R小鼠的BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著高于Sham組；miR-204 mimics組BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著低于mimics-NC組。這一結(jié)果說明上調(diào)miR-204的表達可有效降低心肌損傷標志物BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平，對I/R小鼠心肌組織損傷的恢復具有促進意義。分析原因可能與上調(diào)miR-204表達對SOCS2的表達具有抑制作用有關(guān)，因為SOCS2的高表達對I/R病情的加重具有調(diào)控作用。

心肌組織病理學異常及心肌纖維化程度加劇均為I/R損傷常見的病理特征，本研究發(fā)現(xiàn)，I/R小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，病灶區(qū)出現(xiàn)大量炎性細胞的浸潤，心肌細胞腫大，且心肌纖維化明顯，而miR-204 mimics組小鼠上述病理狀態(tài)較陰性對照組明顯減輕。提示上調(diào)miR-204的表達對減輕I/R小鼠心肌組織病理損傷及心肌纖維化具有促進意義。研究報道，炎癥反應在I/R發(fā)病進展中發(fā)揮著重要作用，其中促炎因子，如TNF-a、IL-1β、IL-6，已成為心肌功能異常的關(guān)鍵損害因子。促炎因子的釋放將對心肌組織出現(xiàn)大量炎性細胞因子的浸潤具有促進作用，還能造成毛細血管阻塞及細胞毒性物質(zhì)的合成，最終引發(fā)急性組織損傷。本研究結(jié)果顯示，I/R小鼠的TNF-a、IL-1β、IL-6水平均顯著高于Sham組；I/R組與mimics-NC組之間的炎癥因子水平無顯著性差異，miR-204 mimics組炎癥因子水平均顯著低于mimics-NC組。提示，miR-204的高表達可有效降低血清中炎癥因子水平，降低炎性反應。分析原因可能是因為miR-204對2具有負調(diào)控作用，而有研究報道2可通過抑制JAK/STAT通路來降低TNF-a、IL-6等炎癥因子水平。為了進一步證實miR-204與2之間的作用關(guān)系，本研究通過生物信息網(wǎng)站預測二者之間存在結(jié)合位點，且采用雙熒光素酶報告實驗證明了2是miR-204的靶基因。進一步說明，miR-204對I/R病理機制的調(diào)控是通過靶向抑制2表達來發(fā)揮作用的。

綜上所述，上調(diào)miR-204的表達，能減輕小鼠I/R病理學狀態(tài)，改善心肌損傷指標水平，降低炎癥反應，其作用原因可能與抑制2的表達有關(guān)。