董起杭，萬里新，張 凱,王 卓,陶海云,杜云輝,高社干,蘭子君,原 翔

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.南陽市中心醫(yī)院腫瘤內科，河南 南陽 473000；3.南陽市中心醫(yī)院放射治療科，河南 南陽 473000；4.南陽市中心醫(yī)院藥學科，河南 南陽 473000；5.河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科，河南 洛陽 471003；6.河南省腫瘤表觀遺傳學重點實驗室，河南 洛陽 471003)

食管癌發(fā)病率的地區(qū)差異較大，我國食管癌發(fā)病率和病死率分別居世界第6位和第4位[1-3]，且食管鱗狀細胞癌約占我國食管癌的88%[4]。放射治療作為食管癌的重要治療手段之一，常與手術、化學治療等治療手段聯(lián)合應用于臨床治療中。鹽酸安羅替尼是我國自主研發(fā)的一種新型口服酪氨酸激酶抑制劑，能夠選擇性抑制血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血小板衍生生長因子受體、纖維母細胞生長因子受體、干細胞因子受體c-Kit等激酶的活性，進而抑制腫瘤血管生長，發(fā)揮抗腫瘤效應[5-7]。鹽酸安羅替尼針對肺癌、腎癌、軟組織肉瘤等的多種臨床試驗已經(jīng)取得了積極的結果[8-11]。但目前關于安羅替尼聯(lián)合放射治療對食管鱗狀細胞癌細胞的作用的研究較少。本研究旨在探討安羅替尼聯(lián)合放射治療對食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、凋亡及放射治療敏感性的影響，以期為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞由河南省腫瘤表觀遺傳學重點實驗室贈予并保存。

1.2 主要試劑與儀器鹽酸安羅替尼原料藥(國藥準字H20180002，純度：99.3%)購自連云港潤眾制藥有限公司，細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本東仁化學科技(上海)有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海Hyclone公司，胎牛血清、青鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，結晶紫染液購自福州Phygene公司，Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒購自上海Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司，全自動酶標儀、細胞培養(yǎng)箱購自上海Thermo Fisher Scientific公司，全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)Tanon 5200購自上海天能科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組將KYSE-150細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

收集對數(shù)生長期的KYSE-150細胞，胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基重懸，以每孔3 000個細胞接種于96孔板中培養(yǎng)12 h，并隨機分為 0 μmol·L-1安羅替尼組、2 μmol·L-1安羅替尼組、4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組，每組設3個復孔，分別用100 μL含終濃度為0、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1安羅替尼的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

另收集對數(shù)生長期KYSE-150細胞，胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，并隨機分為0 Gy單獨照射組、2 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組、2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組，每組設置3個復瓶。0 Gy單獨照射組、2 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組分別用不含安羅替尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，再次更換不含安羅替尼的培養(yǎng)液，并分別給予0、2、4、6 Gy的X射線照射；0 Gy聯(lián)合照射組、2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組使用含終濃度4 μmol·L-1安羅替尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，更換為不含安羅替尼的培養(yǎng)液，同時分別給予0、2、4、6 Gy的X射線照射。

1.4 CCK-8法檢測不同濃度安羅替尼組KYSE-150細胞的增殖能力0 μmol·L-1安羅替尼組(對照孔)、2 μmol·L-1安羅替尼組、4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組細胞使用不同濃度安羅替尼干預24、48、72 h時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入110 μL 含體積分數(shù)10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)]/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。實驗重復3 次，取均值。應用Graphpad Prism 8軟件繪制細胞抑制曲線并計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，選擇IC50值最小時的安羅替尼濃度及處理時間作為后續(xù)實驗的藥物處理條件。

1.5 平板克隆形成實驗檢測不同X射線吸收劑量的單獨照射組和聯(lián)合照射組細胞的克隆形成能力收集0 Gy單獨照射組(單獨對照組)、2 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組(聯(lián)合對照組)、2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞，胰蛋白酶消化、重懸，以每孔500個細胞接種于 6 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成肉眼可見的細胞集落后，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞表面，甲醛固定，結晶紫染色30 min，存活細胞被染成紫色，使用全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，并計數(shù)紫色細胞克隆數(shù)。應用Image J軟件計數(shù)細胞集落，根據(jù)克隆個數(shù)計算各組細胞存活率，細胞存活率=實驗組紫色細胞克隆數(shù)/對照組紫色細胞克隆數(shù)×100%，存活率越高表示放射線對細胞的殺傷能力越低。

1.6 單擊多靶模型檢測安羅替尼聯(lián)合放射治療對KYSE-150細胞放射治療的敏感性將0 Gy單獨照射組、2 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組歸為單獨照射組，將0 Gy聯(lián)合照射組、2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞歸為聯(lián)合照射組。應用Sigma Plot 10.0軟件，以單擊多靶模型[12]擬合單獨照射組和聯(lián)合照射組的細胞存活曲線,存活分數(shù)(survival fractions，SF)=1-(1-e-D/D0)，D為照射劑量，D0為存活曲線指數(shù)區(qū)下降63%的SF所需放射劑量。放射增敏比(sensitizer enhancement ratio，SER)=單獨照射組D0值與聯(lián)合照射組D0值的比值。SER>1說明聯(lián)合照射組細胞對放射治療敏感性高于單獨照射組。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況取0 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組經(jīng)過相應干預后換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h的細胞，胰蛋白酶消化，2 000 r·m-1離心5 min，取沉淀物，PBS沖洗，計數(shù)后調整細胞密度為1×105L-1的細胞懸液，使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒處理細胞，按照試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，應用Flowjo軟件計算細胞凋亡率。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 8組KYSE-150細胞增殖能力比較結果見表1。安羅替尼干預24 h時，2 μmol·L-1安羅替尼組、4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率均顯著高于0 μmol·L-1安羅替尼組(P<0.05)，且4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率隨安羅替尼干預濃度的升高而升高(P<0.05)。安羅替尼干預48、72 h時，0 μmol·L-1安羅替尼組、2 μmol·L-1安羅替尼組、4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率隨安羅替尼干預濃度的升高而升高(P<0.05)。0 μmol·L-1安羅替尼組細胞安羅替尼干預24、48、72 h時的增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。安羅替尼干預48 h時，4 μmol·L-1安羅替尼組、8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率顯著高于安羅替尼干預24 h后同藥物處理濃度的安羅替尼組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。安羅替尼干預72 h時，8 μmol·L-1安羅替尼組、16 μmol·L-1安羅替尼組、32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組、128 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率顯著高于安羅替尼干預24 h時同藥物處理濃度的安羅替尼組，2 μmol·L-1安羅替尼組顯著低于安羅替尼干預24 h，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。安羅替尼干預72 h時，32 μmol·L-1安羅替尼組、64 μmol·L-1安羅替尼組細胞的增殖抑制率顯著高于安羅替尼干預48 h時同藥物處理濃度的安羅替尼組，2 μmol·L-1安羅替尼組顯著低于安羅替尼干預48 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。安羅替尼處理食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞24、48、72 h時的IC50值分別為(12.7±0.5)、(3.7±1.0)、(6.8±0.7)μmol·L-1。

表1 8組KYSE-150細胞增殖能力比較

2.2 安羅替尼對細胞放射治療敏感性的影響2 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組、2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率分別為(96.3±2.1)%、(85.7±1.9)%、(70.1±1.2)%、(84.2±0.7)%、(70.1±0.8)%、(41.4±1.6)%。2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率均顯著低于相同照射劑量的單獨照射組(t=9.468、13.107、24.855，P<0.05)。4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組細胞的存活率均顯著低于2 Gy單獨照射組，6 Gy單獨照射組細胞的存活率顯著低于4 Gy單獨照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.483、18.762、12.024，P<0.05)。4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率均顯著低于2 Gy聯(lián)合照射組，6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率顯著低于4 Gy聯(lián)合照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=22.974、42.448、27.789，P<0.05)。單獨照射組和聯(lián)合照射組的D0值分別為5.84、4.11 Gy,SER為1.42。

2.3 安羅替尼聯(lián)合放射治療對KYSE-150細胞凋亡的影響結果見圖1。0 Gy單獨照射組、4 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組細胞的凋亡率分別為(2.5±0.2)%、(6.2±2.2)%、(7.4±2.3)%、(14.9±3.3)%。4 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組細胞凋亡率顯著高于0 Gy單獨照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.901、3.676、6.496,P<0.05)。4 Gy聯(lián)合照射組細胞凋亡率顯著高于4 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.799、3.230,P<0.05)。4 Gy單獨照射組與 0 Gy聯(lián)合照射組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.653，P>0.05)。

A:0 Gy單獨照射組；B：4 Gy單獨照射組；C：0 Gy聯(lián)合照射組；D:4 Gy聯(lián)合照射組。

3 討論

放射治療作為惡性腫瘤治療的重要手段之一，在頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著極為重要的作用。近年來，隨著精確放射治療的發(fā)展，三維適形放射治療、適形調強放射治療等技術使腫瘤接受到足夠的照射劑量的同時降低周圍正常組織受量，從而提高放射治療的療效[13]。但在不改變傳統(tǒng)體外放射治療方式的前提下，周圍正常組織耐受劑量仍是限制放射治療劑量的重要因素，因此，需要尋找其他方式來提高放射治療的療效。VEGFR1參與腫瘤細胞血管的形成,其在腫瘤組織中的表達與患者的預后和放射治療的療效具有相關性，提示產(chǎn)生放射抵抗的部分原因是腫瘤組織表達的血管表皮生長因子水平較高[14-15]。安羅替尼作為VEGFR抑制劑可能通過抑制腫瘤血管生成而提高放射治療對腫瘤患者的療效。

SHI等[16]通過建立食管癌患者來源的移植瘤小鼠模型探討安羅替尼聯(lián)合放射治療、化學治療的臨床效果，結果顯示，放射治療聯(lián)合安羅替尼組小鼠的腫塊生長抑制程度顯著高于對照組(未接受治療)、單獨放射治療組、放射治療+順鉑組，且未觀察到放射治療聯(lián)合安羅替尼組小鼠發(fā)生嚴重不良反應，這項實驗為安羅替尼的臨床應用提供了新思路，但仍需要大規(guī)模臨床試驗驗證。本研究結果發(fā)現(xiàn)，安羅替尼呈劑量依賴性對食管鱗狀細胞癌細胞發(fā)揮增殖抑制作用，說明安羅替尼可抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖能力。本研究結果顯示，安羅替尼處理KYSE-150細胞24、48、72 h時的IC50值分別為(12.7±0.5)、(3.7±1.0)、(6.8±0.7)μmol·L-1，處理48 h時的IC50值最低，因此后續(xù)實驗均以48 h為安羅替尼處理細胞時間，以安羅替尼處理KYSE-150細胞48 h的IC50值4 μmol·L-1為后續(xù)實驗的藥物處理劑量。

本研究結果顯示，2 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率均顯著低于相同照射劑量的單獨照射組,4 Gy單獨照射組、6 Gy單獨照射組細胞的存活率均顯著低于2 Gy單獨照射組，4 Gy聯(lián)合照射組、6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率均顯著低于2 Gy聯(lián)合照射組，6 Gy單獨照射組細胞的存活率顯著低于4 Gy單獨照射組，6 Gy聯(lián)合照射組細胞的存活率顯著低于4 Gy聯(lián)合照射組，說明安羅替尼聯(lián)合放射治療對食管癌細胞的殺傷能力高于單獨放射治療，且X射線照射量越高殺傷能力越強。此外，本研究結果顯示，單獨照射組和聯(lián)合照射組的D0值分別為5.84、4.11 Gy,SER為 1.42，SER>1說明聯(lián)合照射組細胞對放射治療敏感性高于單獨照射組，提示安羅替尼能增加食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞對放射治療的敏感性。有研究表明，處于G2、M、G1細胞周期的腫瘤細胞對放射線照射比較敏感，而S期腫瘤細胞對放射線照射敏感性較低[17]。腫瘤細胞經(jīng)過抑制VEGFR藥物處理后，處于S期的細胞數(shù)量會明顯減少[18]，安羅替尼可抑制VEGFR活性，這部分解釋了安羅替尼增加食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞對放射治療敏感性的機制。

張昊等[19]通過研究小細胞肺癌患者1 a生存率及血清中凋亡因子caspase-3、多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]表達水平來探討放射治療聯(lián)合安羅替尼對小細胞肺癌患者預后的影響，結果顯示，放射治療聯(lián)合安羅替尼較單獨放療患者血清中caspase-3水平明顯提高，PARP水平明顯降低，且1 a生存率更高，提示安羅替尼可通過與放射治療協(xié)同促進小細胞肺癌細胞的凋亡。為探究安羅替尼對食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞增殖的抑制作用及增加放射治療敏感性的機制，本研究使用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。研究表明，KYSE-150細胞放射治療后的IC50值為4.3 Gy[20]，因此本研究選取其近似值4 Gy作為放療照射劑量。本研究結果發(fā)現(xiàn)，4 Gy單獨照射組、0 Gy聯(lián)合照射組、4 Gy聯(lián)合照射組的細胞凋亡率顯著高于0 Gy單獨照射組，4 Gy聯(lián)合照射組細胞凋亡率顯著高于4 Gy單獨照射組、0 Gy單獨照射組，說明安羅替尼聯(lián)合放射治療對KYSE-150細胞的凋亡作用高于單獨放射治療，且X射線照射量越高對細胞的促凋亡作用越強，提示安羅替尼聯(lián)合放射治療可能是通過促進細胞凋亡來抑制KYSE-150細胞的增殖及增加放射治療敏感性。

綜上所述，安羅替尼聯(lián)合放射治療可抑制食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞的增殖能力，并增加食管鱗狀細胞癌細胞對放射治療的敏感性，其機制可能是促進細胞凋亡。但本研究未能從細胞周期、細胞信號傳導通路及動物實驗等方面對放射治療增敏機制做進一步的探究，仍需后續(xù)實驗完善。