雞c-myc 原癌基因反義RNA 的鑒定及其抗ALV-J 能力的分析

駱 歡，張瑾麒，朱姝桐，柴文嫻，陳緒靖，陳世豪，耿拓宇，崔恒宓*，胡序明*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.常州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 常州 213002）

禽白血病病毒（Avian Ieukosis virus，ALV）屬于禽反轉(zhuǎn)錄病毒科C 型腫瘤病毒，由該病毒引起的禽白血病每年給全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原性差異、病毒干擾試驗(yàn)和基因組的特性，雞ALV 可劃分為A、B、C、D、E、J 和最新分離發(fā)現(xiàn)的K 亞群[1-2]。ALV-J 自1988 年在英國(guó)的肉雞中分離鑒定后迅速蔓延至世界各地，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于1999年從商品化肉雞中首次分離到ALV-J，并于2004年首次報(bào)道商品化蛋雞ALV-J 感染病例。近年來，ALV-J 株呈現(xiàn)新的變異趨勢(shì)[3-4]。目前，ALV-J 已成為我國(guó)各種類型雞群中危害最嚴(yán)重的ALV 流行亞群，且至今尚無有效的ALV-J 商品化疫苗和特效藥物。

宿主表觀遺傳調(diào)控，特別是非編碼RNA，可能與ALV-J 的侵入、感染、復(fù)制以及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)雞miR-375 作為一種新的腫瘤抑制microRNA與ALV-J的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，且參與ALV-J感染和腫瘤發(fā)生[5]，但常在ALV-J 感染雞肝臟組織中的表達(dá)下調(diào)[6]；而雞miR-23b和miR-34b-5p分別通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF1）[7]和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）[8]促進(jìn)ALV-J 復(fù)制。另外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA 同樣涉及ALV-J 感染。研究還發(fā)現(xiàn)表觀遺傳藥物，如DNA 甲基化抑制劑，可以顯著激活反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA lnc-ALVE1-AS1 并抑制ALV-J 的感染和復(fù)制[9]。這些研究不僅為理解ALV-J 的致病機(jī)制和宿主抗病機(jī)理提供了重要線索，還為開發(fā)有效的新型疫苗提供重要思路和研究策略。

與ALV-A和ALV-B主要引起淋巴瘤不同，ALV-J感染主要引起髓樣細(xì)胞瘤。原癌基因c-myc被鑒定為ALV-J 誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞瘤的常見整合位點(diǎn)[10]，其異常激活可能是ALV-J 最重要的分子致病機(jī)制[11]。因此，推測(cè)通過降低c-myc表達(dá)是一種抵抗ALV-J 感染及其誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞瘤發(fā)生的有效策略，為驗(yàn)證該推測(cè)，本研究經(jīng)PCR 擴(kuò)增并表達(dá)了一種抑制原癌基因c-myc表達(dá)的反義RNA：ch-MYC-AS1，進(jìn)一步分析其過表達(dá)對(duì)c-myc原癌基因表達(dá)和ALV-J 復(fù)制的影響，以期為探究c-myc原癌基因反義RNA在ALV-J 致病機(jī)理中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料雞巨噬細(xì)胞系（HD11）和ALV-J JS09GY3 株由揚(yáng)州大學(xué)秦愛建教授惠贈(zèng)；真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清FBS 購自美國(guó)Gibco 公司；SMARTer?RACE 5'/3' Kit 和XfectTMTransfection Reagent 購自TaKaRa 公司；RNA-easy Isolation Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMIX for qPCR（+gDNA wiper）、熒光染料ChamQ SYBR qPCR、Taq酶和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、胰蛋白酶、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購自蘇州新賽美生物科技有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamH I 和XbaI 均購自美國(guó)NEB 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA 純化試劑盒購自美國(guó)Omega Bio-tek 公司；pGEM-T-easy Vector 購自美國(guó)Promega 公司；Anti-c-Myc 抗體購自Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自Sigma公司；鼠抗HA MAb購自Santa Cruz Biotechnology。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成分別參照GenBank 中的雞c-myc基因序列（NM_001030952.1）、雞GAPDH 基因序列（NM_204305.1）和ALV-J 病毒JS09GY3 毒株基因序列（GU982308.1），采用Primer premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 的引物，序列信息見表1，表中下劃線標(biāo)注的小寫字母代表酶切位點(diǎn)序列，未加下劃線的小寫字母代表HA標(biāo)簽序列。檢測(cè)引物委托Thermo Fisher Scientific和蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本研究所使用的qPCR引物Table 1 The qPCR primers used in this study

1.3 ch-MYC-AS1 的PCR 擴(kuò)增及其蛋白編碼的屬性分析

1.3.1 ch-MYC-AS1 的cDNA 末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE） 利用TRIzol?Reagent 提取雞巨噬細(xì)胞系HD11 總RNA，經(jīng)RNasefree DNase I 去除基因組。利用SMARTScribe Reverse Transcriptase（試劑盒提供）將1 μg 去除基因組的RNA反轉(zhuǎn)錄合成5'-或3'-RACE 產(chǎn)物。按照SMARTer?RACE 5'/3'Kit的操作說明，采用通用引物UPM分別與5'-末端或3'-末端基因特異性引物（Gene-specific primer，GSP）ch-MYC-AS1-5-race/ch-MYC-AS1-3-race進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序分析ch-MYC-AS1的5'末端和3'末端序列。

1.3.2 ch-MYC-AS1 的PCR 擴(kuò)增 利用RNA-easy Isolation Reagent 提取雞巨噬細(xì)胞系HD11 總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為模板，采用引物ch-MYC-AS1-F/ch-MYC-AS1-R，利用常規(guī)PCR 擴(kuò)增ch-MYC-AS1。PCR 產(chǎn)物通過TA 克隆測(cè)序分析ch-MYC-AS1 的全長(zhǎng)cDNA 序列。

1.3.3 ch-MYC-AS1 的蛋白編碼屬性分析 為了分析ch-MYC-AS1 是否具有蛋白編碼屬性，本研究在ch-MYC-AS1 全長(zhǎng)擴(kuò)增上游引物（F）中加入起始密碼子ATG +HA 標(biāo)簽序列，HA 標(biāo)簽序列后通過不加T、加1 個(gè)T 和加2 個(gè)T 以實(shí)現(xiàn)ch-MYC-AS1 所有3 種編碼蛋白的可能性。以HD11細(xì)胞cDNA作為模板，分別采用引物HA-ch-MYC-AS-F/HA-ch-MYC-AS-R、HA-Tch-MYC-AS-F/HA-ch-MYC-AS-R 和HA-TT-ch-MYCAS-F/HA-ch-MYC-AS-R，利用常規(guī)PCR 分別擴(kuò)增

3種全長(zhǎng)ch-MYC-AS1，分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，重組質(zhì)粒經(jīng)克隆測(cè)序和酶切鑒定正確后分別命名為pcDNA3.1-HA-ch-MYC-AS1、pcDNA3.1-HA-T-ch-MYC-AS1和pcDNA3.1-HA-TT-ch-MYC-AS1。將HEK293T 細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)至70%融合度后，利用XfectTMTransfection Reagent 分別將pcDNA3.1-HA-ch-MYC-AS1（2 μg）、pcDNA3.1-HA-T-ch-MYC-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-HA-TT-ch-MYC-AS1（2 μg）表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。同時(shí)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA-TP53 質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，以鼠抗HA MAb（1∶1 000）為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 分析ch-MYC-AS1 編碼蛋白情況。

1.4 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-ch-MYC-AS1的構(gòu)建與鑒定以HD11細(xì)胞cDNA作為模板，采用引物ch-MYC-AS1-HindⅢ-F/ch-MYC-AS1-BamH I-R，PCR 擴(kuò)增ch-MYC-AS1，PCR 產(chǎn)物回收后與pGEM-T載體于16 ℃連接過夜，測(cè)序正確的連接產(chǎn)物命名為pGEM-T-ch-MYC-AS1。將該質(zhì)粒與pcDNA3.1（+）（Invitrogen）過表達(dá)質(zhì)粒載體分別經(jīng)HindⅢ/BamH I 酶切，回收酶切產(chǎn)物ch-MYC-AS1 和pcDNA3.1（+）載體，利用T4 DNA ligase 于22 ℃連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，命名為pcDNA3.1-ch-MYC-AS1。

1.5 過表達(dá)ch-MYC-AS1 對(duì)宿主細(xì)胞c-myc原癌基因表達(dá)影響的檢測(cè)

1.5.1 ch-MYC-AS1 過表達(dá)后c-myc原癌基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè) 將HD11 細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)至70%融合度時(shí)，采用XfectTMTransfection Reagent 分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ch-MYC-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）。41 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，利用RNA-easy Isolation Reagent 試劑盒提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMIX for qPCR（+gDNA wiper）將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA 產(chǎn)物稀釋后通過熒光定量PCR 檢測(cè)原癌基因c-myc和內(nèi)參基因GAPDH 的轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.5.2 ch-MYC-AS1 過表達(dá)后c-myc原癌基因蛋白水平的檢測(cè) 按照1.5.1 的操作步驟將pcDNA3.1-ch-MYC-AS1 和pcDNA3.1-GFP 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HD11 細(xì)胞。41 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，分別以鼠抗c-mycMAb（1∶2 000）和兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶2 000）為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測(cè)ch-MYC-AS1 過表達(dá)后對(duì)c-myc原癌基因蛋白表達(dá)水平的影響。

1.6 過表達(dá)ch-MYC-AS1 對(duì)ALV-J 復(fù)制影響的檢測(cè)

1.6.1 ch-MYC-AS1過表達(dá)后ALV-J p27蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 將HD11細(xì)胞鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其生長(zhǎng)至70%融合度后，采用MOI 5 的ALV-J（JS09GY3 株）感染細(xì)胞，41 ℃、5% CO2孵育4 h 后，采用XfectTMTransfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑分別將pcDNA3.1-ch-MYC-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11 細(xì)胞。41 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h 后，分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞樣品，利用IDEXX 禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中ALV-J p27 蛋白表達(dá)水平。

1.6.2 ch-MYC-AS1 過表達(dá)后ALV-J 囊膜基因表達(dá)水平的檢測(cè) 將1.6.1 收集的細(xì)胞樣品一分為二，一部分利用1.5.1 中的熒光定量PCR 方法檢測(cè)ch-MYCAS1 過表達(dá)后ALV-J 囊膜基因envmRNA 和內(nèi)參基因GAPDH 的轉(zhuǎn)錄水平。另一部分，以鼠抗ALV-J 囊膜蛋白MAb JE9（1∶300）和兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶2 000）為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 和抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，利用western blot 檢測(cè)ALV-J囊膜蛋白Env 和內(nèi)參蛋白GAPDH 的表達(dá)水平。

1.6.3 ch-MYC-AS1 過表達(dá)后ALV-J 效價(jià)的檢測(cè) 于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將1.6.1 收集的細(xì)胞上清原液按10-1、10-2、10-3、……10-1210 倍倍比稀釋后接種雞胚成纖維細(xì)胞DF-1，每個(gè)稀釋度重復(fù)8 個(gè)孔，37 ℃孵育4 h，更換新鮮的DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)液并于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d～7 d 后，4%多聚甲醛固定，以鼠抗ALV-J 囊膜蛋白MAb JE9（1∶300）為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000）為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光分析，并計(jì)算出ALV-J的TCID50。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析與作圖采用GraphPad Prism 5.0 軟件對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和作圖，所有數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)比較組間差異。*表示P＜0.05，差異顯著；**表示P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ch-MYC-AS1 蛋白編碼屬性分析結(jié)果本試驗(yàn)通過RACE 擴(kuò)增后測(cè)序分析結(jié)果顯示，正確擴(kuò)增了ch-MYC-AS1 的5'-RACE 序列（圖1A）和3'-RACE序列（圖1B）。在此基礎(chǔ)上，通過PCR 擴(kuò)增ch-MYCAS1，并進(jìn)行TA 克隆測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得了621 bp的ch-MYC-AS1 全長(zhǎng)序列（圖1C），該反義RNA 定位于雞2號(hào)染色體，且源自c-myc原癌基因外顯子3反向序列（圖1D）。通過生物信息學(xué)分析和蛋白翻譯系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示ch-MYC-AS1 不編碼蛋白（圖1E），屬于非編碼RNA。

圖1 ch-MYC-AS1的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.1 The identification results of ch-MYC-AS1

2.2 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-ch-MYC-AS1的構(gòu)建與鑒定結(jié)果通過PCR 擴(kuò)增獲得含有HindⅢ和BamH I 酶切位點(diǎn)的ch-MYC-AS1 全長(zhǎng)序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約600 bp 處可見明顯條帶，與目的序列大小一致（圖2A），測(cè)序結(jié)果顯示其與已鑒定的ch-MYC-AS1 序列同源性達(dá)100%，表明正確擴(kuò)增得到含有HindⅢ和BamH I 酶切位點(diǎn)的ch-MYCAS1 序列。pcDNA3.1-ch-MYC-AS1 重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamH I 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在約5 000 bp 和600 bp處可見目的條帶（圖2B），測(cè)序結(jié)果同上。以上結(jié)果表明ch-MYC-AS1片段已經(jīng)正確插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ch-MYC-AS1的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ch-MYC-AS1

2.3 過表達(dá)ch-MYC-AS1 對(duì)c-myc原癌基因表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果將pcDNA3.1-ch-MYC-AS1 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HD11 細(xì)胞后，利用熒光定量PCR 和western blot 分別檢測(cè)原癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與GFP 對(duì)照組相比，c-myc原癌基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在ch-MYC-AS1 轉(zhuǎn)染后48 h的HD11細(xì)胞中均顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖3）。表明過表達(dá)ch-MYC-AS1 可以抑制c-myc原癌基因在巨噬細(xì)胞HD11 中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

圖3 過表達(dá)ch-MYC-AS1對(duì)c-myc原癌基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of ch-MYC-AS1 overexpression on the expression of c-myc proto-oncogene

2.4 過表達(dá)ch-MYC-AS1 對(duì)ALV-J 復(fù)制影響的檢測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證ch-MYC-AS1 是否也具有抵抗腫瘤病毒ALV 增殖的能力，采用MOI 5 的ALV-J感染HD11 細(xì)胞后，將pcDNA3.1-ch-MYC-AS1 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h 使用IDEXX 禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中ALV-J p27 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示過表達(dá)ch-MYCS1 顯著降低細(xì)胞上清中ALV-J p27 蛋白表達(dá)（P＜0.01）（圖4A）。進(jìn)一步利用熒光定量PCR 和western blot 檢測(cè)ALV-J 囊膜基因env轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與GFP 對(duì)照組相比，ALV-Jenv基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在ch-MYC-AS1 轉(zhuǎn)染后48 h 的HD11 細(xì)胞均顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖4B、圖4C）。利用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)DF-1 細(xì)胞上清中ALV-J 的病毒效價(jià)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HD11 上清中的ALV-J的病毒效價(jià)在ch-MYC-AS1轉(zhuǎn)染后48 h顯著降低（P＜0.01）（圖4D）。以上結(jié)果表明過表達(dá)ch-MYCAS1可以抑制ALV-J在巨噬細(xì)胞HD11中的增殖。

圖4 過表達(dá)ch-MYC-AS1對(duì)ALV-J復(fù)制的影響Fig.4 The effect of ch-MYC-AS1 overexpression on the replication of ALV-J

3 討 論

研究表明，宿主表觀遺傳調(diào)控，特別是非編碼RNA，可能與ALV-J 感染和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[5,9]。由于ALV-J 是一個(gè)禽類致癌反轉(zhuǎn)錄病毒，ALV-J 感染引起宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)同時(shí)，也會(huì)激活宿主癌基因的異常表達(dá)而利于腫瘤的形成。因此，揭示ALV-J 致癌的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制也是ALV-J 致病機(jī)制研究的一個(gè)重要科學(xué)問題。

反義RNA 是一種普遍存在的內(nèi)源性調(diào)節(jié)RNA。能轉(zhuǎn)錄反義RNA 轉(zhuǎn)錄子的基因無處不在[12-14]。通過生物信息學(xué)方法已經(jīng)證實(shí)，小鼠和人存在大量正義-反義轉(zhuǎn)錄序列[15]。哺乳動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)錄子中，70%的轉(zhuǎn)錄子有反義RNA，且反義RNA 的異常能影響正義基因的正常表達(dá)[16]。許多反義RNA 屬于長(zhǎng)非編碼RNA，它們主要以RNA 的形式參與多層次的調(diào)控，包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后RNA 水平的調(diào)控。與小非編碼RNA 如miRNA 和piRNA 一樣，它們是基因信息傳遞過程中基因表達(dá)時(shí)空性調(diào)控的有效調(diào)節(jié)因子。本研究團(tuán)隊(duì)前期通過篩查反義-正義cDNA 文庫發(fā)現(xiàn)人原癌基因c-myc存在反義RNA（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。而致癌基因c-myc的發(fā)現(xiàn)途徑就是通過對(duì)致癌反轉(zhuǎn)錄病毒引起的雞暴發(fā)性腫瘤的早期研究開始的[17]，那雞c-myc原癌基因是否也存在反義RNA？如果存在，對(duì)c-myc基因和ALV-J增殖有何影響？這些問題尚待研究。

HD11 是重要的免疫細(xì)胞，常用于家禽抗病毒研究，且其被禽骨髓細(xì)胞瘤病毒MC29 轉(zhuǎn)化，因此具有腫瘤化特性，這種特性與c-myc基因過表達(dá)相關(guān)。盡管ALV-J 感染主要引起髓樣細(xì)胞瘤，但與禽骨髓細(xì)胞瘤病毒MC29 捕獲c-myc形成v-myc 癌基因不同，ALV-J 不攜帶癌基因，其感染引起的髓樣細(xì)胞瘤可能與c-myc異常激活有關(guān)[11]。因此本研究選擇雞巨噬細(xì)胞系HD11 作為體外模型來探索雞c-myc原癌基因反義RNA 對(duì)ALV-J 增殖的影響。本研究團(tuán)隊(duì)前期通過構(gòu)建HD11 細(xì)胞雙鏈RNA 文庫和高通量測(cè)序已發(fā)現(xiàn)雞c-myc原癌基因外顯子中可能存在反義RNA，本研究進(jìn)一步證實(shí)雞c-myc第3 個(gè)外顯子存在反義RNA，并通過RACE 及PCR 克隆其全長(zhǎng)序列，命名為ch-MYC-AS1。

研究發(fā)現(xiàn)在ALV 易感品系雞中，由于“強(qiáng)”病毒啟動(dòng)子的插入，前病毒整合入c-myc原癌基因后[18]，由病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Long terminal repeats，LTR）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)c-myc基因高水平表達(dá)，從而誘發(fā)法氏囊淋巴瘤[19]。ALV 感染后致癌蛋白MYC 的異常高水平表達(dá)影響了雞法氏囊組織基因的表達(dá)，這是導(dǎo)致淋巴瘤發(fā)生的重要原因[20]。而在ALV 抗性品系雞體內(nèi)，會(huì)減少由病毒啟動(dòng)子LTR 驅(qū)動(dòng)的c-myc 基因異常表達(dá)[21]，以阻止ALV 通過c-myc 原癌基因誘導(dǎo)淋巴瘤[22]。本研究發(fā)現(xiàn)在HD11 細(xì)胞中過表達(dá)ch-MYCAS1 可以顯著抑制雞c-myc基因mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并且RT-qPCR 和western blot 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ch-MYC-AS1 可以顯著抑制ALV-J 囊膜基因env轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平；病毒效價(jià)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)，ELISA 檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)ch-MYC-AS1可以顯著抑制ALV-J 衣殼蛋白p27 蛋白表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明ch-MYC-AS1 可以抑制ALV-J 在巨噬細(xì)胞HD11 中的增殖。因此，推測(cè)ch-MYC-AS1 可能主要通過抑制原癌基因c-myc表達(dá)來影響ALV-J 的增殖及其誘導(dǎo)的髓樣細(xì)胞瘤，通過降低致癌蛋白MYC 的表達(dá)是一種抵抗ALV-J 感染及其誘導(dǎo)的髓樣細(xì)胞瘤發(fā)生的有效策略。然而，關(guān)于ch-MYC-AS1抑制ALV-J增殖的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)c-myc原癌基因反義RNA 可以抑制c-myc表達(dá)和ALV-J 增殖，該結(jié)果不僅對(duì)基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)研究均具重大意義，也對(duì)抗腫瘤病毒研究具有重要意義。隨著癌基因衍生的反義RNA 在抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤病毒增殖中的作用及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制的逐漸解析，其有望成為新型的抗腫瘤和抗病毒藥物。