侯千禧，顧宣強(qiáng)，劉家奇，李雅倩，夏芃芃，段強(qiáng)德，朱國強(qiáng)

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇省重要?jiǎng)游飩魅静∨c人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

沙門氏菌有2 600 多種血清型，其中腸炎沙門氏菌在人和多種動(dòng)物中具有廣泛的宿主適應(yīng)性，是導(dǎo)致人類食物中毒的主要病原菌之一[1]。禽產(chǎn)品是腸炎沙門氏菌的主要感染源，腸炎沙門氏菌引起人類食物中毒的同時(shí)也對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了重大影響[2]。

SEF14 菌毛是腸炎沙門氏菌感染過程重要的毒力因子，是一種伴侶-推進(jìn)（Chaperone-usher）菌毛，沙門氏菌sef14 操縱子位于一個(gè)較小的毒力島上，完整的sef14操縱子基因由5 個(gè)基因組成，分別為sefA、sefB、sefC、sefD和sefR。其中，sefA編碼SEF14菌毛的主要亞單位蛋白SefA，該基因已被克隆、測序，僅分布于部分血清D 群沙門氏菌中[3]。sefB編碼伴侶蛋白，是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，作用為避免SefA 主要亞單位蛋白的非活性聚集及其在組裝前的酶降解。sefC編碼推進(jìn)蛋白，該蛋白位于外膜中，負(fù)責(zé)組織、裝配菌毛亞單位并使其穿過外膜蛋白，以活性蛋白形式表達(dá)于細(xì)菌的表面。sefD編碼SEF14 菌毛的頂端結(jié)構(gòu)，為一種假定黏附素。sefR是一種反向調(diào)節(jié)基因，與sefD相連，其編碼的AraC 樣調(diào)節(jié)蛋白能夠激活sef操縱子基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。

基于上述對(duì)SEF14 菌毛的探索，本研構(gòu)建了重組菌pBR322-sef14/SE5000M，通過凝集試驗(yàn)、SDSPAGE、western blot 和透射電鏡及免疫電鏡檢測，證明SEF14 菌毛在修飾的大腸桿菌SE5000M 中得到了表達(dá)。在凝集試驗(yàn)中，其可與腸炎沙門氏菌陽性雞血清特異性結(jié)合，并能夠在2 min 內(nèi)用肉眼觀察到清晰的凝集顆粒，證明了該重組菌能夠用于腸炎沙門氏菌檢測方法研究。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步探究SEF14 菌毛和建立特異性診斷技術(shù)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)過修飾的大腸桿菌SE5000M菌株由美國賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院Dieter Schifferli博士惠贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SE50336 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表達(dá)質(zhì)粒pBR322 和限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；SefA（SEF14菌毛的主要亞基）單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)室制備；重組SefA 蛋白（包含6×His 標(biāo)簽）由本實(shí)驗(yàn)室制備；Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；NC 膜購自中國夏普有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（IgG-HRP）購自德國Novus 公司；膠體金標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 購自Sigma 公司；通用型DNA 純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；腸炎沙門氏菌、雞白痢、雞傷寒、鼠傷寒沙門氏菌陽性雞血清由本實(shí)驗(yàn)室通過標(biāo)準(zhǔn)株按常規(guī)程序免疫SPF 雞3 次后獲?。籓1 型、O2 型和O78 型大腸桿菌陽性SPF 雞血清由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院高崧教授提供。

1.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定參照腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SE50336 基因序列，利用Oligo7 軟件設(shè)計(jì)sef14操縱子基因擴(kuò)增引物（表1），下劃線標(biāo)記分別代表SphI和SalI酶切位點(diǎn)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。利用上述引物，以提取的腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SE50336 DNA為模板，PCR擴(kuò)增sef14操縱子基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)SphI和SalI酶切后，克隆于經(jīng)同樣酶切處理的pBR322載體中，經(jīng)XbaI和SalI限制性內(nèi)切酶酶切及測序鑒定，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR-sef14。

表1 sef14操縱子基因的PCR擴(kuò)增引物Table 1 The primers used for PCR amplification of sef14

1.3 重組菌的凝集反應(yīng)鑒定將pBR-sef14和空載體pBR322 分別電轉(zhuǎn)化至經(jīng)修飾且不含任何菌毛的大腸桿菌SE5000M，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，陽性重組菌分別命名為pBR-sef14/SE5000M 和pBR322/SE5000M。將重組菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，菌量調(diào)整為5×109cfu/mL，用無菌生理鹽水洗滌3 次。取10 μL 菌液和等量SefA（SEF14 菌毛的主要亞基）MAb（1∶40），分別滴于干凈的玻璃板上，使其混合，慢慢搖晃，在2 min 之內(nèi)，肉眼觀察有無凝集顆粒。

1.4 重組菌的透射電鏡及免疫電鏡觀察將pBRsef14/SE5000M 和pBR322/SE5000M 接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h后，取1 mL培養(yǎng)物，4 000 r/min離心10 min，棄上清，用等量PBS 洗滌3 次后重懸。取50 μL 菌液滴于蠟紙上，將含支持膜的銅網(wǎng)漂浮于液滴的表面，室溫靜置15 min；用濾紙吸盡銅網(wǎng)上多余的菌液，將銅網(wǎng)漂浮于2%磷鎢酸染液液滴的表面（pH7.0）；用濾紙吸盡銅網(wǎng)上多余的染液，倒扣于濾紙上，待干后對(duì)上述樣品進(jìn)行透射電鏡觀察[6]。

用上述同樣的方法處理菌液，將含支持膜的銅網(wǎng)漂浮于菌液液滴的表面，室溫靜置15 min；吸盡銅網(wǎng)上殘余菌液，用1%脫脂乳室溫封閉10 min；吸盡殘余液體后，先用SefA MAb（1∶1 000）室溫孵育30 min，PBST 洗滌3 次，再用膠體金標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶50）室溫孵育60 min，PBST 洗滌3 次；吸盡殘余液體，用2%磷鎢酸負(fù)染3 min，待干后經(jīng)免疫電鏡觀察[7]。

1.5 菌毛蛋白的提取將pBR-sef14/SE5000M 接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，采用改進(jìn)的熱萃取法提取SEF14 菌毛蛋白[8]，其步驟為：菌液培養(yǎng)物在4 ℃，4 500 r/min 離心10 min，棄去上清，用無菌PBS 洗滌兩次。加入75 mmol/L NaCl-0.5 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）溶液，62 ℃水浴30 min，8 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，加入20%飽和硫酸銨沉淀過夜，14 000 r/min，離心30 min，棄去上清后，用無菌PBS 垂懸后備用。

1.6 菌毛蛋白的SDS-PAGE 及western blot 鑒定將1.5 所得SEF14 菌毛蛋白和重組SefA 蛋白（包含6×His 標(biāo)簽）經(jīng)SDS-PAGE 后，利用Bio-RAD 轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC 膜上，4 ℃，10%牛血清白蛋白封閉過夜。次日用PBST 洗滌3 次后，加入SefA MAb（1∶1 000）。37 ℃孵育1 h 后，用PBST洗滌3 次，加入羊抗小鼠IgG-HRP（1∶1 500），37 ℃孵育2 h，洗滌3 次，二氨基聯(lián)苯胺染色，利用western blot 鑒定SEF14 菌毛蛋白[9]。

1.7 重組菌特異性靶向檢測腸炎沙門氏菌依據(jù)1.3 所述方法制備pBR-sef14/SE5000M 作為凝集抗原，同時(shí)以pBR322/SE5000M 為陰性對(duì)照，檢測重組菌pBR-sef14/SE5000M 與SPF 雞陰性血清、腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、O1 型、O2 型和O78 型大腸桿菌陽性SPF雞血清（各10 份，共計(jì)80 份）的凝集反應(yīng)性，從而檢驗(yàn)重組菌pBR-sef14/SE5000M 對(duì)腸炎沙門氏菌的特異性靶向檢測功能。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pBR-sef14的構(gòu)建與鑒定以腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SE50336 為模板，SEF-UP/SEF-DO 為引物PCR 擴(kuò)增sef14操縱子基因， PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，在約4 300 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A）。將sef14克隆至pBR322 表達(dá)質(zhì)粒中，對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別用XbaI 和SalI 酶切鑒定，結(jié)果顯示目的片段大小約為8 200 bp，酶切結(jié)果與預(yù)期大小一致（圖1B），表明正確構(gòu)建了pBR-sef14重組質(zhì)粒。

圖1 sef14操縱子基因PCR擴(kuò)增（A）及pBR322-sef14的酶切鑒定結(jié)果（B）Fig.1 The result of sef14 operon gene PCR amplification and restriction digestion of pBR-sef14 plasmid

2.2 重組菌與SefA MAb 凝集反應(yīng)結(jié)果將重組菌pBR-sef14/SE5000M 和pBR322/SE5000M 分別與SefA MAb 混合，結(jié)果顯示，重組菌pBR-sef14/SE5000M 能與SefA MAb 產(chǎn)生凝集反應(yīng)，而pBR322/SE5000M 不與SefA MAb 發(fā)生反應(yīng)。表明重組菌pBR-sef14/SE5000M能夠表達(dá)SEF14 菌毛蛋白。

2.3 重組菌的透射電鏡及免疫電鏡觀察結(jié)果在透射電鏡及免疫電鏡下觀察重組菌pBR-sef14/SE5000M和pBR322/SE5000M，透射電鏡結(jié)果顯示，pBRsef14/SE5000M 表面有明顯的菌毛結(jié)構(gòu)，而陰性對(duì)照pBR322/SE5000M 表面無菌毛結(jié)構(gòu)（圖2）。在電鏡觀察的基礎(chǔ)上，用SefA MAb 和膠體金標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 分別孵育后進(jìn)行免疫電鏡觀察，結(jié)果顯示，經(jīng)過上述抗體孵育處理后，在pBR-sef14/SE5000M 的菌毛表面吸附有黑色膠體金顆粒，陰性對(duì)照pBR322/SE5000M 未觀察到上述現(xiàn)象（圖2），由此可初步斷定表達(dá)的菌毛為SEF14 菌毛，表明重組菌pBR-sef14/SE5000M 能夠表達(dá)SEF14 菌毛。

圖2 重組菌pBR322-sef14/SE5000M和pBR322/SE5000M的透射電鏡圖（50 000×）及免疫電鏡圖(73 000×)Fig.2 Transmission electron microscope image(50 000×)and immunoelectron micrograph(73 000×)of pBR322-sef14/SE5000M and pBR322/SE5000M

2.4 菌毛蛋白的SDS-PAGE 和western blot 分析將菌毛蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和western blot 鑒定，結(jié)果顯示，pBR-sef14/SE5000M 的表達(dá)產(chǎn)物大小約為14.3 ku（圖3A），與菌毛的主要亞基SefA 的大小一致。本研究還使用了帶有6×His 標(biāo)簽的重組SefA 作為對(duì)照，其大小約為15.2 ku（6×His 標(biāo)簽的大小約為0.9 ku）（圖3B），表明重組菌能夠表達(dá)SEF14 菌毛。SEF14 菌毛僅存在于D 群沙門氏菌中，Thorns 等首先在腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌分離株中檢測到了SEF14 菌毛的表達(dá)[10]，并報(bào)道了SEF14 菌毛僅表達(dá)于D 群沙門氏菌血清型中的腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、非常罕見的布利丹沙門氏菌和莫斯科沙門氏菌[11]。Turcotte 等證實(shí)了類似的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)sefA基因在雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌中是保守的，但雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌不表達(dá)SEF14 菌毛的具體原因尚不清楚[12]。

圖3 SEF14菌毛蛋白的SDS-PAGE（A）和western blot（B）分析Fig.3 SDS-PAGE(A)and western blot(B)identification of SEF14 fimbriae protein

2.5 重組菌特異性靶向檢測腸炎沙門氏菌利用pBR-sef14/SE5000M 和pBR322/SE5000M 對(duì)10 份陰性雞血清和70 份不同病原菌人工感染的雞血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，pBR-sef14/SE5000M 能夠與10 份腸炎沙門氏菌陽性雞血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與陰性雞血清、雞傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌陽性雞血清均不反應(yīng)，敏感性為100%，特異性為100%，而對(duì)照重組菌pBR322/SE5000M 與所有血清均不反應(yīng)，表明重組菌pBRsef14/SE5000M 可以用于特異性檢測腸炎沙門氏菌感染?？紤]到在D 群沙門氏菌中只有腸炎沙門氏菌能夠表達(dá)SEF14 菌毛，因此可以采用血清學(xué)方法，利用SEF14 菌毛特異性檢測家禽中的腸炎沙門氏菌感染，例如，利用SefA（分子量為14.3 ku）MAb 包被乳膠顆粒用于鑒別腸炎沙門氏菌[13]。Rajashekara 等改進(jìn)了乳膠顆粒凝集試驗(yàn)方法，用SefA 重組蛋白代替MAb 包被的乳膠顆粒，但他們并沒有檢測腸炎沙門氏菌感染樣品，也沒有報(bào)道該方法的靈敏度[14]。

本研究克隆了腸炎沙門氏菌的sef14操縱子基因，并證明其能在SE5000M中良好表達(dá)，初步構(gòu)建了腸炎沙門氏菌pBR-sef14/SE5000M-pBR322/SE5000M 檢測系統(tǒng)，凝集試驗(yàn)顯示，pBR-sef14/SE5000M可以與腸炎沙門氏菌陽性雞血清特異性結(jié)合，能夠在2 min內(nèi)用肉眼觀察到清晰的凝集顆粒，而pBR322/SE5000M 不能特異性識(shí)別腸炎沙門氏菌陽性雞血清。本研究為進(jìn)一步研究SEF14菌毛、建立腸炎沙門氏菌特異性檢測方法和技術(shù)平臺(tái)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。