電針輔助全身麻醉對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制*

穆彥 劉新燕 齊勝娟

(1.保定市第二中心醫(yī)院麻醉科，河北 保定 071000；2.邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000；3.涿州市醫(yī)院麻醉科，河北 涿州 072750)

麻醉可以消除患者手術過程中疼痛和恐懼，是手術過程至關重要的環(huán)節(jié)。麻醉的好壞直接影響手術的成功率及患者的生命健康。西醫(yī)麻醉具有麻醉效果快、無痛等優(yōu)勢，是臨床手術麻醉的主流方式。但是研究表明西醫(yī)麻醉會不同程度的影響患者的生理功能，導致麻藥不耐受患者出現(xiàn)術后并發(fā)癥如認知功能障礙，誘發(fā)機體炎癥反應等[1-2]。電針麻醉是針刺麻醉法之一，指針刺入穴位后接通電麻儀(電針機)，通過毫針輸入電流刺激達到鎮(zhèn)痛效果以施行手術的方法。它是在電針療法的基礎上發(fā)展起來的一種針麻方法，普遍應用于各種針麻手術。電針麻醉有很好的鎮(zhèn)痛作用，電針麻醉可以改善疼痛涉及生物體多種生物活性分子，包括神經(jīng)遞質、神經(jīng)調質、神經(jīng)肽、細胞信號分子和炎性介質等的分泌表達，減緩疼痛感受[3-4]。同時針刺麻醉具有對患者生理擾亂小、穩(wěn)定人體內環(huán)境、提高機體防御能力、延長麻醉效果、操作簡便安全經(jīng)濟等優(yōu)越性，在臨床麻醉上受到廣泛重視[5]。研究表明在大鼠體外循環(huán)手術過程中使用針刺輔助麻醉能顯著改善大鼠術后機體損傷[6]。心梗冠狀動脈搭橋手術是臨床上常見的手術治療方式，手術過程采用西醫(yī)全身麻醉，由于搭橋后心臟會出現(xiàn)再灌注損傷，且手術時間相對較長，合適的麻醉方式對患者的預后是至關重要的。因此，如何從麻醉角度降低麻醉對手術的影響及改善缺血再灌注損傷是在急性心梗手術中麻醉的研究熱點。本研究在大鼠缺血再灌注損傷模型中使用針刺輔助全身麻醉，探究該種麻醉方式對手術后機體反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 人促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，大鼠肌酸激酶MB型同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于Cayman公司，大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒購于Humasis公司，大鼠炎癥因子白細胞介素1b(IL-1b)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子a(TNF-α)檢測試劑盒購于R&D公司，PE-Anti-CD45抗體、BV421-Anti-Ly6G抗體、FITC-Anti-CD11b抗體、APC-Anti-F4/80抗體購于BD公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物有限公司，抗大鼠半胱氨酸天冬酸蛋白酶-3(Caspase 3)、GAPDH抗體購于Abcam公司。

1.2 實驗動物 20只9周齡SPF雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%。實驗動物處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型建立 隨機將大鼠分成對照組和干預組，每組10只。兩組大鼠手術過程均使用吸入七氟烷進行誘導維持麻醉，使用脫毛膏去除胸部前外側毛發(fā)；常規(guī)消毒，切開皮膚、肌層，在左側第4肋間隙開胸，以環(huán)形鉤拉出心臟。在左心耳下方3～4 mm處冠脈前降支位置，以6/0無損傷絲線穿線，并置直徑1.6 mm 尼龍線，連同冠狀動脈前降支一起結扎，另一端留于體外備用；將心臟放回胸腔，排空胸腔內空氣，關閉胸腔；結扎30 min后小心移除尼龍線進行再灌注[7]。除七氟烷麻醉外，干預組大鼠在手術前30 min開始，使用電針對大鼠穴位百會、合谷、內關、足三里進行電刺激并維持至手術結束。

1.3.2 外周血因子檢測 外周血花生四烯酸乙醇胺(AEA)和CRF檢測：取兩組模型大鼠手術前和手術后12 h外周血，置于肝素抗凝管中。采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術對大鼠血漿中AEA水平進行測定：取3 mL血漿，加入0.5 mL甲苯，混勻后10000 rpm離心10 min。微孔過濾后，取1 mL濾過液，使用氮氣揮干，然后加入衍生化試劑DBD-COCl衍生化，然后使用HPLC檢測樣品中AEA衍生化合物水平，根據(jù)外標定量，確定血漿中AEA水平。使用人CRF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，大鼠CK-MB、LDH檢測試劑盒，大鼠cTnI檢測試劑盒、大鼠IL-1b、IL-6、TNF-α檢測試劑盒檢測大鼠外周血中CRF、CK-MB、LDH、cTnI、IL-1b、IL-6、TNF-α水平，具體檢測方法參照試劑盒使用說明書。

1.3.3 大鼠心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA表達水平檢測 手術后12 h麻醉處死大鼠，取大鼠心臟再灌注區(qū)組織。取部分再灌注區(qū)組織，采用Trizol法提取組織中RNA，然后反轉錄獲得cDNA，采用Realtime PCR法檢測大鼠心臟再灌注區(qū)組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平。IL-1b qPCR引物：上游，5′-CGA GAGGATGTTCCAATGCA-3′，下游5′-GTTCTGC AAACTGGCAGGAA-3′；IL-6 qPCR引物：上游，5′-GACGAGAGCCAGTTTAGCAT-3′，下游5′-TGGA GCTTCACTGGAAGACA-3′；TNF-α qPCR引物：上游5′-GGAGGCGCTAATTCGTTAGC-3′，下游5′-C CTTGGGGATGATACACATG-3′。

1.3.4 大鼠心臟組織炎癥細胞浸潤水平檢測 手術后12 h麻醉處死大鼠，剖開胸腹，暴露心臟，使用10 mL肝素生理鹽水，從左心室緩慢注入心臟，直至心臟變白無血色，然后取下心臟，剪取20 mg再灌注區(qū)心臟組織，放入EP管中，加入酶消化液，使用剪刀剪碎，然后置于37℃溫箱中震蕩消化，10 min后取出，使用200目金屬網(wǎng)過濾，濾過液即為制備好的單細胞懸液。取100 mL單細胞懸液，分別于PE-Anti-CD45抗體、BV421-Anti-Ly6G抗體、FITC-Anti-CD11b抗體、APC-Anti-F4/80抗體避光冰上孵育30 min，然后使用流式細胞儀檢測分析單細胞懸液中炎癥細胞數(shù)量。在CD45和CD11b雙陽性細胞群中，分別找到Ly6G單陽性(中性粒細胞)及Ly6G和F4/80雙陽性細胞(巨噬細胞)。

1.3.5 大鼠心肌細胞凋亡檢測 使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標記熒光檢測法)對大鼠心臟再灌注損傷區(qū)心肌細胞凋亡情況進行分析，具體方法參照試劑盒說明書；使用熒光顯微鏡對染色后的心臟組織進行拍照，選取心臟缺血區(qū)上、下、左、右、中5個區(qū)域，每個區(qū)域分別拍2張照片，然后使用Image pro plus對組織中凋亡細胞數(shù)目進行計數(shù)。

1.3.6 western blot檢測 手術后12 h麻醉處死大鼠，取大鼠心臟再灌注區(qū)組織，使用RIPA裂解液對組織進行裂解。使用western blot對裂解液中活化Caspase 3水平進行分析檢測。

2 結果

2.1 各組大鼠手術前后血漿CK-MB、cTnI和LDH水平變化 ELISA檢測結果顯示，手術前，兩組血漿CK-MB、cTnI和LDH水平比較無明顯差異(P>0.05)；手術后，兩組血漿CK-MB、cTnI和LDH水平均較手術前顯著升高(P<0.05)，且干預組顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠手術前后血漿CK-MB、cTnI和LDH水平變化

2.2 各組大鼠手術前后血漿IL-1b、IL-6、TNF-α水平變化 ELISA檢測結果顯示，手術前，兩組血漿IL-1b、IL-6和TNF-α水平比較無明顯差異(P>0.05)；手術后，兩組血漿IL-1b、IL-6和TNF-α水平均較手術前顯著升高(P<0.05)；且干預組顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠手術前后血漿IL-1b、IL-6、TNF-α水平變化

2.3 各組大鼠手術前后血漿AEA和CRF水平變化 液相和免疫檢測發(fā)現(xiàn)，手術前，兩組大鼠血漿AEA、CRF水平比較均無明顯差異(P>0.05)；手術后，對照組血漿AEA、CRF水平與手術前比較無明顯差異(P>0.05)，干預組血漿AEA、CRF水平顯著高于手術前，且顯著高于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠手術前后血漿AEA和CRF水平變化

2.4 大鼠模型手術后心肌細胞凋亡情況 TUNEL檢測結果顯示，手術后干預組組織凋亡細胞數(shù)目相比于對照組組織顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠心臟再灌注區(qū)心肌細胞凋亡情況

2.5 大鼠模型手術后心臟組織活化Caspase 3表達水平變化 Western blot檢測結果顯示，手術后干預組組織活化caspase 3表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠心臟再灌注區(qū)心臟組織活化Caspase 3表達水平

2.6 大鼠模型手術后心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平變化 Realtime PCR檢測結果顯示，手術后干預組組織IL-1b、IL-6和TNF-α mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 大鼠模型手術后心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平變化

2.7 大鼠模型手術后心臟組織炎癥細胞浸潤變化 流式細胞術檢測結果顯示，手術后干預組組織中性粒細胞(Ly6G陽性、F4/80陰性)和巨噬細胞(Ly6G和F4/80雙陽性)水平顯著低于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 大鼠心臟再灌注區(qū)中性粒細胞和巨噬細胞浸潤情況

3 討論

心臟手術引發(fā)的心臟缺血再灌注損傷能夠誘發(fā)患者術后心肌發(fā)生不可逆損傷進而導致心功能衰退，嚴重影響患者預后。因此如何降低心肌缺血再灌注損傷是心臟手術的研究熱點。麻醉持續(xù)整個手術過程，圍手術期的心肌保護是臨床麻醉研究的焦點之一。中醫(yī)學認為，通過穴位刺激可以達到鎮(zhèn)痛和控制生理紊亂的效果，使手術患者在鎮(zhèn)痛的同時保持生理平衡[5]。目前中醫(yī)針灸輔助麻醉在多種外科手術過程中展現(xiàn)出積極的作用。

血液中CK-MB活性、LDH活性和cTnI含量與心肌細胞損傷程度呈正相關[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉大鼠模型術后外周血中CK-MB、LDH和cTnI水平顯著低于對照組，表明電針輔助麻醉能夠能夠顯著改善手術導致的心肌缺血再灌注損傷。在心臟缺血再灌注損傷過程中，心肌細胞凋亡水平顯著升高，導致收縮細胞喪失及心肌細胞代償性肥大，從而進一步促使心臟缺血再灌注病情惡化[8]。近年研究表明刺激百會、合谷、內關、足三里通過抑制炎癥反應、氧化應激抑制疼痛及細胞損傷、凋亡[6,11-13]。本研究電針輔助麻醉能夠顯著降低大鼠心臟再灌注區(qū)心肌細胞凋亡數(shù)目，進一步檢查發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉能夠顯著抑制心肌組織中活化的Caspase 3的水平。這些結果表明電針輔助麻醉能夠顯著的抑制術后心肌再灌注損傷。

炎癥反應是心肌缺血再灌注損傷的主要分子機制，通常炎癥細胞如中性粒細胞或巨噬細胞當收到心肌組織再灌注刺激信號時，會被募集到心臟缺血再灌注區(qū)域，然后浸潤至心肌組織中，進一步釋放炎癥因子等，誘發(fā)心肌細胞凋亡等現(xiàn)象[14-15]。此外，炎癥水平與疼痛密切相關，炎癥反應會激活神經(jīng)免疫反應，并釋放炎性介質，刺激并與傷害性感受器末端相應的受體結合，持續(xù)的炎性刺激可使傷害性感受器發(fā)生痛覺敏化[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)電針麻醉能夠具有抑制機體炎癥反應，改善炎癥性疼痛功能。本研究發(fā)現(xiàn)電針輔助能夠降低大鼠模型外周血中炎癥因子IL-1b、IL-6、TNF-α蛋白水平以及心臟缺血區(qū)IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平，顯示電針輔助麻醉可能是通過抑制心臟再灌注區(qū)組織炎癥反應而抑制心肌損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉顯著抑制了心臟再灌注區(qū)組織中中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)目。這些結果表明電針輔助麻醉改善術后心肌損傷的分子機制與抑制心肌組織的炎癥反應有關。

內源性大麻素AEA和促腎上腺皮質激素釋放因子CRF在疼痛調控中起著關鍵作用[19]。研究表明大麻素受體選擇性缺失能夠顯著的增強神經(jīng)疼痛。此外，研究發(fā)現(xiàn)AEA具有抗氧化、抗炎、誘導低溫狀態(tài)產(chǎn)生的功能，而這些功能在外科手術過程中均扮演積極的作用。CRF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，研究表明腦內注射CRF具有顯著的鎮(zhèn)痛效果。此外研究還顯示CRF通過下丘腦-垂體-腎上腺軸調節(jié)機體炎癥等免疫應激[20]。AEA及CRF的表達分泌受神經(jīng)系統(tǒng)的調控，而本研究發(fā)現(xiàn)電針刺激穴位能夠顯著增加大鼠術后外周血中AEA和CRF水平，表明電針輔助麻醉通過促進AEA和CRF的產(chǎn)生，進而緩解疼痛及機體炎癥反應。

4 結論

電針輔助麻醉能抑制大鼠機體炎癥反應，改善機體炎性疼痛及心肌再灌注損傷，其分子機制與AEA及CRF介導的炎癥反應有關，為臨床上使用電針輔助麻醉提供了實驗依據(jù)。