張正聰 朱曉亮 張彥軍 袁得峰 呂鵬飛 白小平 朱克祥

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)普外科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外二科，甘肅 蘭州 730000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球各類惡性腫瘤中發(fā)病率位居第3位，死亡率位居第2位[1]，我國CRC的發(fā)病率及死亡率在所有惡性腫瘤中均居第5位[2]，并呈逐年上升的趨勢。由于CRC患者就診時多數(shù)已進入進展期甚至已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前對于晚期CRC患者只能采取化療為首的綜合性治療[3]，但化療在對腫瘤細(xì)胞進行滅活的同時，也會一定程度上損害患者的免疫功能[4]。因此，探索一種更安全有效的晚期CRC治療方式已成為臨床亟待解決的問題。隨著生物治療的深入研究，也為晚期CRC的治療提供了新的思路。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer cell, CIK)能夠使腫瘤細(xì)胞對淋巴細(xì)胞的敏感性增強，可以提高機體抗腫瘤的免疫能力[5]，并且由于其較小的毒副反應(yīng)，安全性也得到了許多學(xué)者認(rèn)可[6]。本研究對晚期CRC患者在應(yīng)用DC-CIK免疫治療聯(lián)合化療后的療效進行回顧性分析，評價其治療的有效性和安全性，旨在為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2013年6月～2016年1月期間在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)住院治療的晚期CRC患者90例，其中采用DC-CIK免疫治療聯(lián)合CapeOX方案化療的45例晚期CRC患者為觀察組，僅采用CapeOX方案化療的45例晚期CRC患者為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第八版)[7]進行分期。②病理證實為結(jié)直腸癌，臨床分期為Ⅲ期或Ⅳ期，未能行手術(shù)治療。③卡氏評分(KPS)≥60分，預(yù)計生存時間≥3個月。④血常規(guī)及肝腎功能均正常。⑤治療前均向患者或家屬告知病情、治療方案及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，并簽署DC-CIK免疫治療和化療知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肺等嚴(yán)重器官功能衰竭或其他惡性腫瘤者。②不能耐受化療及對生物制品有過敏史者。③長期服用免疫抑制劑者。④合并精神障礙者。⑤臨床資料不完整者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗試劑及儀器 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(廈門特寶生物科技有限公司)，鼠抗人CD3單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，白細(xì)胞介素-4(IL-4)(上海創(chuàng)未生物技術(shù)有限公司)，重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)(長春生物制品研究所)，淋巴細(xì)胞分離液(上海山進生物科技有限公司)，血細(xì)胞分離機(美國Terumo BCT公司)。奧沙利鉑注射液(江西恒瑞醫(yī)藥有限公司)，卡培他濱片(上海羅氏制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備自體腫瘤細(xì)胞抗原 將腫瘤組織研磨成漿，經(jīng)膠原酶消化后制成腫瘤單細(xì)胞懸液，用分離液分離后制成原代結(jié)直腸癌細(xì)胞，再經(jīng)過多次傳代并收集，連續(xù)洗滌3次后裂解細(xì)胞，過濾收集上清液儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)及回輸 取外周血后離心獲得單個核細(xì)胞，并接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中。①DC細(xì)胞培養(yǎng)：收集懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞加入含有GM-CSF及IL-4的培養(yǎng)基中，第7天加入自體腫瘤細(xì)胞抗原，致敏后獲取DC細(xì)胞。②CIK細(xì)胞培養(yǎng)：將懸浮細(xì)胞加入含有CIK細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，1 d后加入rhIL-2及抗人CD3單克隆抗體，至第7天與DC細(xì)胞共同培養(yǎng)，最終收獲DC-CIK細(xì)胞。③DC-CIK細(xì)胞回輸：回輸前檢測細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體等均為陰性。回輸細(xì)胞活率>95%，細(xì)胞數(shù)量≥1.0×109個/次。

1.2.3 治療方案 根據(jù)中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020版)[8]，兩組患者均采用CapeOX化療方案：第1～14天，卡培他濱1000 mg/m2；第1天，奧沙利鉑130 mg/m2；用藥結(jié)束后休息1周，3周為1個化療周期，3個化療周期結(jié)束后進行療效評價，根據(jù)患者耐受情況，入組患者共進行6～8周期化療，在化療期間常規(guī)給予保肝、止吐及抗過敏等對癥治療。觀察組患者在予以化療前采外周血用于培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞，采血后當(dāng)日按上述方案進行化療，并于第8天回輸DC細(xì)胞，第11天回輸CIK細(xì)胞，第14天回輸DC-CIK細(xì)胞，每3周為1個周期，接受3個周期治療后評價療效。

1.2.4 觀察指標(biāo) ①免疫功能評價：通過檢測治療前及治療3周期后兩組患者T細(xì)胞亞群(包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK及NKT細(xì)胞)比例，對患者免疫功能進行評價。②近期療效評價：3周期治療后通過實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(Response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)評定兩組患者的療效。完全緩解(Complete response,CR)：全部靶病灶消失，且腫瘤標(biāo)志物水平正常，至少維持4周；部分緩解(Partial response,PR)：靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周；疾病穩(wěn)定(Stable disease,SD)：靶病灶最大徑之和縮小<30%，或增大幅度<20%；疾病進展(Progressive disease,PD)：靶病灶最大徑之和增大幅度≥20%，或出現(xiàn)新病變或轉(zhuǎn)移灶。疾病有效率(Response rate,RR)=(CR+PR)/n×100%，疾病控制率(Disease control rate,DCR)=(CR+PR+SD)/n×100%。③不良反應(yīng)評價：治療期間對兩組患者按照美國國立癌癥研究所《急性和亞急性毒性反應(yīng)表現(xiàn)及分度標(biāo)準(zhǔn)》(NCI-CTCAEv4.0)[9]進行不良反應(yīng)評價，分為0～Ⅳ度，包括發(fā)熱、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及肝功能異常等。④遠(yuǎn)期療效評價：DC-CIK免疫治療及化療結(jié)束后每月進行1次電話或者醫(yī)院復(fù)查隨訪，記錄患者的生存情況和腫瘤的復(fù)發(fā)時間。首要研究終點為病情進展，次要研究終點為死亡，對兩組患者無進展生存(Progression-free survival,PFS)以及總生存(Overall survival,OS)情況進行評價。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者的性別、年齡、臨床分期、分化程度、原發(fā)部位及病理分型等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較[n(×10-2)]

2.2 外周血T細(xì)胞亞群比例變化 對兩組患者治療前及治療3周期后外周血中T細(xì)胞亞群的比例變化進行比較，結(jié)果顯示，觀察組治療前后外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK及NKT細(xì)胞比例無明顯變化(均P>0.05)，而對照組治療后外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK及NKT細(xì)胞比例較治療前顯著下降(均P<0.05)；兩組間治療后比較，對照組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK及NKT細(xì)胞比例明顯低于觀察組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后外周血中T細(xì)胞亞群流式檢測比較

2.3 近期療效評價 3周期治療后，以CT等方法檢測兩組患者RR無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；觀察組DCR明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后近期療效評價[n(×10-2),n=45]

2.4 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較 兩組患者的主要不良反應(yīng)表現(xiàn)為骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、發(fā)熱及肝功能異常等，對癥治療后均可緩解。治療期間觀察組和對照組白細(xì)胞減少、血小板減少發(fā)生率分別為55.6%、42.2%和75.6%、64.4%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組和對照組腹瀉發(fā)生率分別占15.6%和35.6%，兩組比較有明顯差異(P<0.05)。其他相關(guān)不良反應(yīng)，如貧血、發(fā)熱、肝功能異常、外周神經(jīng)毒性及惡心、嘔吐等無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，均經(jīng)對癥處理后恢復(fù)正常。見表4。

表4 兩組患者治療后不良反應(yīng)發(fā)生率比較[n(×10-2)]

2.5 遠(yuǎn)期療效的評價 治療結(jié)束后對兩組患者定期復(fù)查并隨訪，對照組患者的PFS為3～22個月，中位PFS為6.5個月；觀察組患者的PFS為3～26個月，中位PFS為10.5個月。經(jīng)Log-rank檢驗，兩組患者PFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=4.748,P=0.029)(圖1)。對照組患者的OS為6～30個月，中位OS為15個月；觀察組患者的OS為7～32個月，中位OS為19個月。經(jīng)Log-rank檢驗，兩組患者OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=2.379,P=0.123)，見圖2。

圖1 兩組患者PFS曲線

圖2 兩組患者OS曲線

3 討論

隨著當(dāng)前手術(shù)及放化療等抗腫瘤方法在CRC治療中的聯(lián)合使用，CRC患者的治愈率明顯升高，并且生存期也逐漸延長，但傳統(tǒng)的抗腫瘤方法在一定程度上會對機體的免疫功能造成不可逆的損害，從而導(dǎo)致出現(xiàn)頻發(fā)的不良反應(yīng)[10]，因此，腫瘤免疫治療作為目前第四種抗腫瘤手段而被深入研究，并且已經(jīng)在一些實體腫瘤的治療上取得了顯著療效[11]。腫瘤免疫治療是將大量增殖產(chǎn)生并擁有特定功能的免疫細(xì)胞回輸機體內(nèi)，可重塑腫瘤患者免疫系統(tǒng)，清除體內(nèi)腫瘤微小病灶及殘留的癌細(xì)胞，并減少傳統(tǒng)方法治療后不良反應(yīng)的發(fā)生[12]。

DC細(xì)胞作為目前倍受關(guān)注的專職抗原呈遞細(xì)胞，具有攝取、加工及呈遞抗原的作用，并且能有效激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，是機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的啟動者和調(diào)控者[13]。既往臨床研究[14]也已證實DC細(xì)胞對一些惡性腫瘤的治療有明顯療效。CIK細(xì)胞是在體外分離、培養(yǎng)及擴增后獲得的異質(zhì)性細(xì)胞群，具有一定的免疫特性，不僅準(zhǔn)確識別并直接清除腫瘤細(xì)胞，還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)間接滅活腫瘤細(xì)胞[15]，具有培養(yǎng)簡單、抗瘤活性高及使用安全等特點[16]。有研究表明，DC和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后，不僅具有比CIK細(xì)胞更強的抗腫瘤活性，而且還能加速T細(xì)胞增殖，發(fā)揮更強的殺傷腫瘤作用[17]，明顯提高患者的免疫功能，最終有效地抑制腫瘤的生長[18]。

本研究回顧性分析了DC-CIK免疫治療聯(lián)合化療對晚期CRC患者的療效及安全性，結(jié)果顯示，化療后機體的免疫功能明顯下降，而化療聯(lián)合DC-CIK免疫治療后機體免疫功能下降不明顯，說明聯(lián)合治療有可能恢復(fù)機體的抗腫瘤免疫功能,使機體保持較好的免疫狀態(tài)[19]。化療聯(lián)合DC-CIK免疫治療也顯著提高了晚期CRC患者的DCR、PFS，而RR、OS雖有延長的現(xiàn)象，但差異并不明顯，其可能的原因是由于腫瘤組織的免疫抑制性，致使免疫細(xì)胞難以在腫瘤實體內(nèi)發(fā)揮作用[20]。本研究還表明，化療聯(lián)合DC-CIK免疫治療可使患者骨髓抑制和腹瀉的發(fā)生率顯著下降。說明DC-CIK免疫治療不但可以延長生存期，還能提高患者的生存質(zhì)量，并具有較高的安全性。但由于本研究樣本量較小，隨訪時間有限，故研究結(jié)果仍需進一步予以證實。

4 結(jié)論

DC-CIK免疫治療聯(lián)合化療能夠明顯改善晚期結(jié)直腸癌患者的免疫功能，提高抗腫瘤療效，延長無進展生存時間，減少不良反應(yīng)發(fā)生率，可在臨床推廣應(yīng)用。