鐘建琴 付相 黃小瀠 婁金鵬 耿毅然 袁攀 韓雪 洪峰

摘要：為探究兒茶素對高脂飲食小鼠減肥作用及腸道菌群的影響，將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、兒茶素組（0.06%兒茶素+高脂飼料），各組連續(xù)喂養(yǎng)28周，記錄小鼠體質(zhì)量和攝食量，計算肝臟系數(shù)、體脂比和Lee's指數(shù)，檢測血脂指標(biāo)，并采用HE染色觀察小鼠肝臟病理變化，實(shí)時熒光定量PCR檢測小鼠腸道菌群的相對表達(dá)量。研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、體脂比和Lee's指數(shù)明顯增加，血脂指標(biāo)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白（LDL-C）水平明顯高于對照組，高密度脂蛋白（HDL-C）水平明顯降低（P<0.05）;與模型組相比，兒茶素組小鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)及Lee's指數(shù)明顯降低，血脂指標(biāo)TG和LDL-C水平明顯降低、HDL-C水平顯著增加（P<0.05）。肝組織病理結(jié)果顯示，兒茶素組小鼠與模型組相比能明顯改善肝組織病變程度，減少肝損傷;腸道菌群結(jié)果顯示，兒茶素組小鼠擬桿菌相對表達(dá)量明顯高于模型組（P<0.05）。研究結(jié)果表明，兒茶素可顯著減少小鼠攝食量、降低體質(zhì)量、調(diào)節(jié)血脂水平、改善肝組織病變和腸道菌群紊亂，對于高脂飲食小鼠具有較好的減肥作用。

關(guān)鍵詞：兒茶素;高脂飲食;血脂水平;減肥作用;腸道菌群

Effects of Catechins on Weight Loss and

Intestinal Flora in Mice Fed with High Fat Diets

ZHONG Jianqin1， FU Xiang1， HUANG Xiaoying1， LOU Jinpeng1，

GENG Yiran1， YUAN Pan1， HAN Xue1，2*， HONG Feng1*

1. School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China

2. Basic Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China

Abstract： To explore the effects of catechins on weight loss and intestinal flora in mice fed with high-fat diets，mice were randomly divided into control group， model group， and catechin group（0.06% catechin and high-fat diets）. Body weight and food intake of mice were recorded. After 28 weeks of continuous feeding， liver coefficient， body fat ratio， and Lee's index were calculated， and blood lipid indexes were detected. Liver pathological changes were observed by HE staining. Real-time quantitative PCR was used to detect the relative expression of intestinal microflora in mice. Compared with the control group， body weight， liver coefficient， body fat ratio， and Lee's index and the levels of total cholesterol（TC）， triglycerides（TG）， and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）of mice in the model group were significantly increased， but the level of high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） was significantly decreased（P<0.05）. Compared with the model group， body weight， liver coefficient， and Lee's index and the levels of TG and LDL-C of mice in the catechin group were significantly decreased.However， the level of HDL-C was significantly increased（P<0.05）. The pathological results of liver tissues show that the degree of liver lesions was improved and liver injury was reduced in catechin group compared with the model group（P<0.05）. The results of intestinal flora show that the relative expression level of Bacteroidetes in the catechin group was significantly higher than that in the model group（P<0.05）. Therefore， catechins could significantly reduce food intake， body weight， regulate levels of blood lipid， improve liver lesions， and intestinal microflora disorders in mice fed with high-fat diets， and had a good effect on weight loss.

Keywords： catechin， high-fat diet， bloodlipid level， antiobesity action， lntestinal flora

肥胖是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，是指體內(nèi)脂肪堆積過多和分布異常并危害健康的一種狀態(tài)[1]。隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，高熱量、高脂肪食物的攝入已成為肥胖、高脂血癥等代謝性疾病發(fā)生的主要原因，人類的健康與腸道菌群密切相關(guān)，例如肥胖、糖尿病、高血壓等多種疾病的發(fā)生均與腸道菌群的失調(diào)有關(guān)[2-3]。有研究表明，高脂飲食與腸道菌群關(guān)系密切，它可降低腸道菌群的豐富度和多樣性，改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài)，損傷腸道粘膜屏障功能，最終誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[4]。

兒茶素（Catechin）是從茶葉等天然植物中提取出來的一類酚類活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、提高膜穩(wěn)定性等活性。研究顯示兒茶素可以降血脂、降血糖和保護(hù)心腦血管疾病[5-6]。目前，關(guān)于腸道菌群與飲食方面的研究成為了全球熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能夠調(diào)節(jié)飲食中攝入的高脂肪、吸收脂溶性維生素、分解碳水化合物以及合成氨基酸等作用[7]。高脂、高膽固醇飲食會導(dǎo)致腸道菌群多樣性水平降低，主要體現(xiàn)在擬桿菌門和雙歧桿菌數(shù)量下降，厚壁菌門和變形菌門數(shù)量上升，動物實(shí)驗(yàn)和人體研究都有證據(jù)表明脂代謝異常的個體腸道中厚壁菌門與擬桿菌門比例（F/B）會增加[8-9]。

目前，關(guān)于兒茶素減肥作用及其機(jī)制尚不明確，且關(guān)于兒茶素與腸道菌群的研究較少。本研究旨在探討兒茶素對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的減肥作用及其與腸道菌群的關(guān)系，為后續(xù)兒茶素的研發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)和重要參考。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific Multiskan GO公司），CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），高壓蒸汽滅菌器（中國北京盛科信德科技有限公司），干燥箱（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）。兒茶素（江西綠康天然產(chǎn)物有限責(zé)任公司，EGCG純度為90%，不含咖啡堿），血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），糞便基因組DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，TB Green R Premix Ex TaqTM II〔寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司〕，購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司的高脂飼料（43%基礎(chǔ)飼料、20%蔗糖、16%豬油、13%酪蛋白、3%麻油、3%預(yù)混料、2%磷酸氫鈣）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動物及分組處理

選擇18只清潔級C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量持18～21 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組（普通飼料）、模型組（高脂飼料）、兒茶素組（0.06%兒茶素+高脂飼料）3組飼養(yǎng)，每組6只，連續(xù)喂養(yǎng)28周并每周記錄大鼠的體質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：1900227）。

1.3? 小鼠一般情況

記錄小鼠體質(zhì)量及攝食量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后準(zhǔn)確稱量小鼠肝臟、腎周脂肪以及睪周脂肪質(zhì)量，并測量小鼠體長，最后計算小鼠的肝臟系數(shù)、體脂比及Lee's指數(shù)，公式如下[10-11]：

肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100

體脂比=（腎周脂肪質(zhì)量+睪周脂肪質(zhì)量）/體質(zhì)量×100

Lee's指數(shù)=體質(zhì)量^1/3×103/體長

1.4? 小鼠血清生化指標(biāo)檢測

小鼠剪尾取血2 000 r/min離心10 min，分離上層血清，采用試劑盒檢測小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇的含量。

1.5? 小鼠病理學(xué)檢查

摘取肝臟，取肝臟三角葉放入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定、包埋、烤片、脫蠟、常規(guī)HE染色，于顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)改變。

1.6? 小鼠糞便總DNA提取

取新鮮的糞便樣品置于無菌的EP管中，然后立即放入液氮冷凍后置于-80 °C冰箱保存。糞便DNA提取參照TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。取2 μL DNA予以核酸濃度測定儀檢測DNA濃度與純度，所有標(biāo)本OD260/OD280均處在1.7～2.0區(qū)間內(nèi)，表示DNA純度高。

1.7? 實(shí)時熒光定量PCR測定

以總的細(xì)菌為內(nèi)參基因，檢測小鼠糞便中雙歧桿菌、擬桿菌和厚壁桿菌的相對表達(dá)量，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系（10 μL）包括Ultra SYBR Mixture 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，加入滅菌去離子水至10 μL。采用TB Green R Premix Ex TaqTM II試劑盒進(jìn)行操作，經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸，獲得溶解曲線，以檢測擴(kuò)增特異性，PCR反應(yīng)在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，采用2-step PCR法，以總的細(xì)菌為內(nèi)參基因，計算各菌屬的相對表達(dá)量。

1.8? 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組間的比較滿足正態(tài)性、方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），不服從正態(tài)或方差不齊的采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 兒茶素對小鼠體質(zhì)量及攝食量的影響

小鼠體質(zhì)量及攝食量變化情況見表2。各組小鼠初始體質(zhì)量無顯著差異;與對照組相比，模型組小鼠最終體質(zhì)量顯著增加;與模型組相比，兒茶素組小鼠最終體質(zhì)量顯著降低。從攝食量上來看，模型組小鼠的日均攝食量顯著高于對照組，兒茶素組小鼠的日均攝食量顯著低于對照組和模型組。

2.2? 兒茶素對小鼠肝臟系數(shù)、體脂比及Lee's指數(shù)的影響

與對照組相比，模型組小鼠肝臟系數(shù)、體脂比以及Lee's指數(shù)顯著增加。與模型組相比，兒茶素組肝臟系數(shù)和Lee's指數(shù)均顯著下降（表3）。

2.3? 兒茶素對小鼠血脂水平的影響

兒茶素對小鼠血脂水平的影響結(jié)果見表4。模型組小鼠血清中TC、TG及LDL-C水平均顯著高于對照組，HDL-C水平顯著低于對照組。與模型組相比，兒茶素組小鼠TG和LDL-C水平顯著降低、HDL-C水平顯著升高。

2.4? 兒茶素對小鼠肝組織病變的影響

不同處理小鼠肝組織的病理學(xué)觀察結(jié)果如圖1。對照組小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見脂肪空泡;與對照組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞腫脹，脂肪沉積明顯，可見大量肝細(xì)胞脂肪空泡;與模型組相比，兒茶素組小鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性減輕，肝細(xì)胞脂肪空泡減少且變小，情況明顯改善。

2.5? 兒茶素對小鼠腸道菌群的影響

小鼠雙歧桿菌、擬桿菌、厚壁桿菌的相對表達(dá)量如圖2。與對照組小鼠相比，模型組小鼠雙歧桿菌相對表達(dá)量顯著降低;厚壁桿菌相對表達(dá)量顯著增加（P<0.05）;擬桿菌相對表達(dá)量降低，但未達(dá)顯著水平。與模型組小鼠相比，兒茶素組小鼠雙歧桿菌相對表達(dá)量有所增加、厚壁桿菌相對表達(dá)量有所降低，均未達(dá)顯著水平;但兒茶素組小鼠擬桿菌相對表達(dá)量顯著高于模型組（P<0.05）。

3? 小結(jié)與討論

高能量攝取和消耗保持動態(tài)平衡有助于機(jī)體維持正常，但攝取能量大于消耗時，體內(nèi)就會產(chǎn)生過多脂肪堆積從而導(dǎo)致肥胖[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，模型組小鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、體脂比以及Lee's指數(shù)明顯高于對照組，這與長期攝入高熱量的飲食導(dǎo)致脂肪堆積，多余的能量轉(zhuǎn)化為脂肪沉積于體內(nèi)有關(guān)。通過兒茶素干預(yù)，小鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)以及Lee's指數(shù)明顯降低，這與楊麗聰?shù)萚13]研究結(jié)果一致。兒茶素主要通過抑制脂肪相關(guān)酶、增強(qiáng)脂肪酸的氧化能力、抑制食欲使得攝食量減少，進(jìn)而抑制體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)兒茶素能有效降低小鼠TG、LDL-C水平，增加HDL-C水平，與李勤等[15]的研究結(jié)果一致，這與兒茶素能夠通過增強(qiáng)肝臟中脂肪酸的氧化，抑制膽固醇、脂肪酸以及甘油三酸酯的合成有關(guān)[16]。但本研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素對血脂TC水平?jīng)]有影響。

哺乳動物重要的代謝器官是肝臟，它在維持碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝中起著重要作用，大量研究表明攝入高能量食物會導(dǎo)致肝臟脂肪樣病變、功能喪失[17]。肝組織病理結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟組織中有大量空泡樣變，肝臟組織嚴(yán)重受損;兒茶素干預(yù)后可以有效緩解肝臟損傷，減少肝臟脂肪的沉積，這與兒茶素能夠調(diào)節(jié)血脂指標(biāo)，影響脂肪代謝從而抑制肝臟和脂肪中脂質(zhì)積累有關(guān)[18]。小鼠肝臟系數(shù)、血脂指標(biāo)、肝組織病理等研究結(jié)果一致，說明兒茶素對高脂飲食的小鼠具有一定的減肥作用。

腸道微生物組成對脂代謝有重要調(diào)控作用，它可直接參與宿主能量和物質(zhì)代謝[19]。雙歧桿菌是一種重要的生理性有益菌，具有營養(yǎng)作用、免疫增強(qiáng)作用、改善胃腸道功能等多種生理功能。厚壁菌門和擬桿菌門存在相互促進(jìn)的共生關(guān)系，它們共同促進(jìn)宿主吸收或儲存能量，擬桿菌門降低、厚壁菌門增加或擬桿菌門/厚壁菌門比例的降低都會導(dǎo)致肥胖。本研究結(jié)果顯示，兒茶素組小鼠擬桿菌相對表達(dá)量比模型組小鼠明顯增加，這與擬桿菌能抑制小鼠其他有害菌的生長，產(chǎn)生有機(jī)酸刺激腸道蠕動以及降低腸胃膽汁酸含量，增加膽固醇和脂質(zhì)的排出，從而對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖具有顯著抑制作用有關(guān)[20-22]。在本次研究中，與模型組相比，雖然兒茶素組小鼠雙歧桿菌相對表達(dá)量增加，厚壁桿菌相對表達(dá)量降低，但未達(dá)顯著差異，這提示兒茶素可能對厚壁桿菌和雙歧桿菌的變化不敏感。

綜上所述，兒茶素可以減少小鼠攝食量、降低體質(zhì)量、調(diào)節(jié)血脂水平、改善肝組織病變和腸道菌群紊亂，提示兒茶素對高脂飲食小鼠具有較好的減肥作用和改善腸道菌群紊亂，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。

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