◎ 于 倩，宋瑛瑛，宋雅蕓，劉興龍，羅清楠

（1.甘肅省分析測試中心，甘肅 蘭州 730000；2.酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 酒泉 735000）

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）[1]的定義，大腸菌群是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般情況下，大腸菌群、菌落總數(shù)和霉菌等檢測項(xiàng)目是判斷食品衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)，而大腸菌群主要來自人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)用來評價食品的衛(wèi)生狀況，以其檢出情況可推斷出食品是否受到糞便污染[2]。為了確保大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果的可信度，本文依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[3]以及《常用玻璃量》（JJG 196—2006）[4]對同一份枸杞樣品重復(fù)檢測30次，對影響大腸菌群測定不確定度來源進(jìn)行分析，建立一種比較簡單的大腸菌群不確定度評定方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗(yàn)原材料為某公司生產(chǎn)且檢驗(yàn)合格的同一批次枸杞，經(jīng)過人工污染后成為本試驗(yàn)樣品。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。氯化鈉（分析純）由天津市百世化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢驗(yàn)方法

依據(jù)GB 4789.3—2016第一法（大腸菌群稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（Most Probable Number，MPN））進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)流程如下：無菌取樣25 g，加入225 mL生理鹽水，使用均質(zhì)器拍打2 min，制成1∶10的樣品稀釋液，用1 mL無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，在渦旋振蕩器上振蕩混勻制成1∶100的樣品稀釋液。以此類推，制成1∶1 000的樣品稀釋液。選擇1∶10、1∶100和1∶1 000這3個連續(xù)稀釋度的稀釋液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1 mL，（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，（24±2）h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)），如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至（48±2）h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)是用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，接種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者計(jì)為大腸菌群陽性管。

1.4 檢驗(yàn)結(jié)果判定

依據(jù)確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索國標(biāo)中MPN表（見附錄B），得到每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。

2 不確定度來源及評定

2.1 不確定度來源分析

本試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照GB 4789.3—2016第一法檢驗(yàn)步驟執(zhí)行，包括樣品稱量、稀釋、培養(yǎng)及結(jié)果修約等[5]。不確定因素主要包括重復(fù)檢測結(jié)果的不確定度樣品稱量過程的不確定度uc(樣)、倍數(shù)稀釋過程的不確定度uc(總稀釋)等[6]。本文對這些不確定度分別進(jìn)行分析。

2.2 重復(fù)檢測引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 稱樣引起的不確定度

無菌條件下，用最大量程為2 000 g、精度為0.1 g的電子天平稱取樣品25.0 g，依據(jù)電子天平檢定證書，在置信概率為95%時允許誤差為±0.1 g。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 倍數(shù)稀釋過程引起不確定度

制成1∶10的樣品稀釋液時使用250 mL量筒，制成1∶100和1∶1000的樣品稀釋液時使用10 mL和1 mL玻璃移液管。按照檢定證書，在20 ℃時，250 mL量筒、10 mL移液管和1 mL移液管的容量允差分別為±2.0 mL、±0.05 mL和±0.015 mL，則它們的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

則倍數(shù)稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 單一樣品的重復(fù)檢測結(jié)果表

本次試驗(yàn)最大稀釋倍數(shù)為1 000倍，則樣品總稀釋產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u合=u總×1.321=0.033 041。

取置信概率p=95%，自由度v=30-1=29，由t分布表可查得k=2.045，則擴(kuò)展不確定度U=2.045×0.033 041=0.067 569。

3 結(jié)論

除本文提到的3個方面的不確定因素外，還有其他因素，包括樣品保存條件、人員操作、培養(yǎng)溫度和時間等，考慮到這些方面對總不確定度的影響可以忽略不計(jì)。本次只考慮這3方面的不確定因素對枸杞中大腸菌群MPN法不確定度進(jìn)行評估，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室重復(fù)檢測和倍數(shù)稀釋過程對不確定度影響較大，在以后的試驗(yàn)中應(yīng)加強(qiáng)控制。