水產(chǎn)品中孔雀石綠快速檢測產(chǎn)品技術評價研究

◎ 張 凡，王一名，霍思宇，王海玲，余麗波，周 超，祁萌娜，余 洋

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176，2.中檢科（北京）測試認證有限公司，北京 100176）

孔雀石綠（Malachite Green，MG），又稱苯胺綠、孔雀綠、品綠、中國綠，分子式為C23H25ClN2，是一種人工合成的三苯甲烷架構的染料，因其外觀顏色呈孔雀綠而得名，由于其可以用來殺菌和防治寄生蟲而被作為防腐劑廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中?？兹甘G對人體免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)具有嚴重的致癌作用，而濫用孔雀石綠還可能誘發(fā)致病菌的耐藥性，對人體健康構成潛在危害[1-3]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020年公布的第250號公告中，將孔雀石綠列為食品動物中禁止使用的藥品，美國和歐盟也早已禁止在食用性動物中使用孔雀石綠[4-5]。與其他抗真菌劑相比，由于其高效率、低成本和現(xiàn)成可用性，仍在世界許多地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。

目前，關于孔雀石綠類化合物的檢測主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等檢測方法[6-7]。這些方法雖然準確度高、重復性好、適用于定量檢測，但存在成本高、操作煩瑣、設備昂貴、操作人員需專業(yè)培訓和檢測周期長等缺點，難以滿足基層現(xiàn)場快速篩查的需求。近年來，膠體金免疫層析技術發(fā)展迅速，具有前處理簡單、檢測成本低、對操作人員技術水平要求低等優(yōu)點，適宜在基層推廣應用，被認為是目前最具應用價值和發(fā)展?jié)摿Φ目焖贆z測技術[8-10]。在原國家食品藥品監(jiān)督管理總局2017年第58號公告中，也發(fā)布了《水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201701），規(guī)定了快速檢測方法的相關技術要求。因此，為規(guī)范快速檢測的應用，合理發(fā)揮快檢技術的技術優(yōu)勢，有必要對該類快檢產(chǎn)品進行質(zhì)量評價[11-13]。

本研究選用含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質(zhì)控樣品及含有結晶紫和隱色結晶紫干擾物的添加樣品，對4個廠家的孔雀石綠快速檢測試紙條進行測試，對檢出限、靈敏度、特異性、假陽性率和假陰性率等進行評價，以期為基層監(jiān)管工作人員選購及應用孔雀石綠快速檢測試紙條提供參考，推進食品快檢技術在實際監(jiān)管中的應用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質(zhì)控樣品[中檢科（北京）實驗室能力評價有限公司]；魚肉、蝦肉陰性樣品為前期制備質(zhì)控樣過程中飼喂宰殺并經(jīng)國標方法檢測確認的樣品；干擾物樣品為陰性樣品加標并經(jīng)國標方法檢測確認，均勻性穩(wěn)定性符合《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（CNAS—GL003：2018）要求（結晶紫200 μg·kg-1）；評價用快速檢測產(chǎn)品，從市場上購買4個廠家3個不同批次的快速檢測產(chǎn)品；結晶紫（純度99.0%以上，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 儀器與設備

電子天平，ME54.702，瑞士METTLER TOLEDO；均質(zhì)器，F(xiàn)A30，上海弗魯克；水浴氮吹儀，ANPEL DC，上海安譜；渦旋儀，Talboys，上海安譜；移液槍，2 ～ 20 μL，德國 Eppendorf。

1.3 技術指標要求

依據(jù)《水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201701）及中檢科（北京）測試認證有限公司制定的《食品安全快速檢測產(chǎn)品評價指標體系》，快速檢測產(chǎn)品性能指標要求為檢出限≤2 μg·kg-1，靈敏度≥99%，特異性≥85%，假陰性率≤1%，假陽性率≤15%，交叉反應率≤0.1%，批內(nèi)重復性≥96.4%，批間重復性卡方計算＜3.84。

使用陰性空白樣品、1倍檢出限陽性樣品質(zhì)控樣、2倍檢出限陽性樣品質(zhì)控樣、干擾物質(zhì)檢出陽性的最小濃度添加樣品，按照快速檢測說明書規(guī)定的前處理方法和分析步驟進行，并對所有結果進行統(tǒng)計分析，評價快速檢測產(chǎn)品的相關指標是否符合《食品安全快速檢測產(chǎn)品評價指標體系》要求。

1.4 快檢產(chǎn)品的技術指標評價

1.4.1 檢出限評價

為評價快檢產(chǎn)品的檢出限，本實驗采用1倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質(zhì)控樣進行檢測，分別使用3個批次快檢產(chǎn)品，每個批次檢測50份魚肉和50份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析。

1.4.2 靈敏度和假陰性率評價

為評價快檢產(chǎn)品的靈敏度和假陰性率，本實驗采用1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質(zhì)控樣進行檢測，分別使用3個批次快檢產(chǎn)品，每個批次檢測100份魚肉和100份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析，計算靈敏度和假陰性率。

1.4.3 特異性和假陽性率評價

為評價快檢產(chǎn)品的特異性和假陽性率，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品進行檢測，分別使用3個批次快檢產(chǎn)品，每個批次檢測40份魚肉和40份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析，計算特異性和假陽性率。

1.4.4 交叉反應評價

為評價快檢產(chǎn)品的交叉反應，本實驗采用干擾物質(zhì)檢出陽性的最小濃度的魚肉和蝦肉樣品進行檢測，分別使用3個批次快檢產(chǎn)品，每個批次檢測20份魚肉和20份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析，計算交叉反應率。

1.4.5 批內(nèi)重復性評價

為評價快檢產(chǎn)品的批內(nèi)重復性，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質(zhì)控樣進行檢測，使用1個批次快檢產(chǎn)品檢測140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析，計算批內(nèi)重復性。

1.4.6 批間重復性評價

為評價快檢產(chǎn)品的批間重復性，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質(zhì)控樣進行檢測，使用3個批次快檢產(chǎn)品，每個批次檢測140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計分析，計算批間重復性。

2 結果與分析

本次評價實驗選取市面流通中認知度較高的4種基于膠體金原理的孔雀石綠快速檢測產(chǎn)品，產(chǎn)品編號分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在評價實驗前，檢查所有快速檢測產(chǎn)品的包裝、說明書及配套試劑，均包裝密封完好，距離產(chǎn)品到期日4個月以上。此次評價用基質(zhì)及檢測限與產(chǎn)品說明書契合。嚴格按照說明書規(guī)定的操作步驟及方法進行檢測，結果見表1、表2。

表2 評價指標計算結果表

評價結果顯示，4個廠家產(chǎn)品中，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品所有指標符合要求；對于靈敏度和批內(nèi)重復性，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品檢測的兩種基質(zhì)均符合要求，其余3個廠家產(chǎn)品檢測結果靈敏度均＜99%，批內(nèi)重復性＜96.4%，不符合相應指標要求；對于特異性，4個廠家產(chǎn)品檢測的兩種基質(zhì)均≥85%，滿足相應指標要求；對于交叉反應率實驗，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品說明書提到，其余3個廠家均未提到，因此其余3個廠家未做交叉反應率實驗；對于批間重復性，除Ⅳ廠家產(chǎn)品不符合要求外，其余3個廠家均滿足批內(nèi)重復性指標要求；另外對于不同的檢測基質(zhì)，同一廠家產(chǎn)品的檢測效果也存在差異，如II廠家產(chǎn)品的魚肉靈敏度為98.7%，不滿足要求，而蝦肉靈敏度為99.3%，滿足靈敏度指標要求。

3 結論與討論

（1）此次評價的實驗設計中，4個廠家的快速檢測產(chǎn)品均具有國內(nèi)相關機構出具的產(chǎn)品評價報告，相關性能指標顯示較好。但在此次驗證評價的過程中，部分品牌出現(xiàn)性能指標不理想的情況，反映出國內(nèi)目前在售的快速檢測產(chǎn)品與送樣評價的快速檢測產(chǎn)品存在一定的差異性，單純采購前一次評價并不能代表全部生產(chǎn)線產(chǎn)品質(zhì)量，應引入合格評定的概念，由專業(yè)的機構開展全鏈條產(chǎn)品質(zhì)量考察及定期監(jiān)督檢驗，供用戶參考選購。

（2）國內(nèi)目前在開展相關評價實驗過程中，絕大部分機構參照《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（CNAS—GL003：2018），制備均勻性和穩(wěn)定性符合要求的基質(zhì)加標樣品，也有部分機構使用沒有添加樣品基質(zhì)的標準溶液。前者的制備成本較大，后者則忽略了基質(zhì)效應對快速檢測產(chǎn)品的影響。因此，在開展評價實驗過程中，推薦使用的樣品為含有待測目標物的有證基質(zhì)標準物質(zhì)、標準物質(zhì)生產(chǎn)者生產(chǎn)的含有待測目標物的基質(zhì)質(zhì)控樣品或含有待測目標物且均勻性和穩(wěn)定性滿足統(tǒng)計學要求并經(jīng)過參比方法定值的實際樣品或基質(zhì)加標樣品。

（3）在此次評價的4種產(chǎn)品中，僅1種產(chǎn)品在說明書中提示了產(chǎn)品的交叉反應，可能存在部分廠家對交叉反應的重視不夠的情況。產(chǎn)品說明書中應明確提示交叉反應情況，以便用戶在開展快速檢測時對檢測樣品及檢測結果做出恰當?shù)呐袛唷?/p>