范學政，林超群，魏川江，胡志卿，曾振東

（中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）神經(jīng)外科，深圳 518106）

腦出血作為中風的一種亞型，發(fā)病率與死亡率很高，占中風的15%～20%[1]。在過去的10 年中，盡管缺血性中風的治療有一定的進展，但腦出血的治療進展甚微[2]。一些新的治療策略，包括通過某些因子和神經(jīng)保護藥物的使用，也表現(xiàn)出較差的治療結(jié)果[3]。目前，臨床上仍缺少針對腦出血治療的有效手段[4]。MicroRNAs（miRNAs）是近年來在動植物中發(fā)現(xiàn)的一類新的非編碼RNA。miRNA 含有18～26個核苷酸，可通過與特定的mRNA靶點結(jié)合，促進其降解和（或）翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因表達[5]，miRNA的表達異常參與多種病理生理過程，包括器官發(fā)育、細胞生長和細胞分化[6-7]。miR-877 參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括癌癥[8]、骨關節(jié)炎[9]、心肌缺血再灌注[10]。然而，miR-877 對腦出血發(fā)生后繼發(fā)病理改變（或稱二次損傷）的分子機制尚未見相關報道。

星形膠質(zhì)細胞是數(shù)量較多的角質(zhì)細胞，它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞等腦神經(jīng)活動中發(fā)揮重要作用。無論在病理條件下，還是在動物模型中，都可以被誘導成為神經(jīng)元，因此該細胞常被用來作為重編程的理想細胞模型。本課題組前期在腦出血小鼠模型中成功篩選到了miR-877的差異表達，本研究通過采用星形膠質(zhì)細胞構建腦出血模型，研究miR-877 在腦出血后續(xù)繼發(fā)病理改變中的作用，并進一步研究其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM/F12 培養(yǎng)基（Hyclone），F(xiàn)BS（Hyclone），青鏈雙抗（上海生工），細胞培養(yǎng)箱（Thermo），光學顯微鏡（XDS-1A），超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司），離心機（德國Eppendorf 公司），細胞培養(yǎng)箱（Thermo），Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific），Trizol（invitrogen），DEPC處理水（CTCC），氯仿/異丙醇/無水乙醇（上海國藥），PCR引物（上海生工公司），SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo#K1622），Real-time 檢測儀（ABI-7500），TLR4、NFκB、Bax、Bcl-2 和GAPDH 初級抗體、HRP 標記的二抗（Abcam），MTT 試劑（Sigma-Aldrich)，PI（碧云天C1052），75%乙醇（無錫展望），流式細胞儀（BDFACSVerse）（BD-C6），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（貝博生物401006），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA Kit（elabscience E-EL-R2856c），白細胞介素（IL）-6 ELISA Kit（elabscience E-EL-R0015c），IL-1β（elabscience E-EL-R0012c），酶聯(lián)免疫吸附儀（TECAN）。

1.2 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SD大鼠星形膠質(zhì)細胞用含有20%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。根據(jù)處理條件不同分為空白組、血紅蛋白組、miR-877 mimic 組，miR-877 mimic NC 組。其中，miR-877 mimic 組處理條件為星形膠質(zhì)細胞接種于培養(yǎng)基上1 d 后，將50 nmol/L 的miR-877 mimic 加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加入血紅蛋白（20 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；miR-877 mimic NC 組處理條件為星形膠質(zhì)細胞接種于培養(yǎng)基上1 d 后，將50 nmol/L的miR-877 mimic NC 加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后加入血紅蛋白（20 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；血紅蛋白組加入血紅蛋白（20 μmol/L）培養(yǎng)24 h；空白組加入等體積的PBS培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT 法檢測大鼠腦星形膠質(zhì)細胞增殖 收集細胞并采用MTT 法檢測細胞增殖水平。將密度為5×103/孔的細胞接種于96孔板，加入100 μL培養(yǎng)基孵育24 h。20 μL 5 mg/mL的MTT試劑加入到培養(yǎng)基中孵育4 h后，懸浮于150 μL二甲亞砜中，570 nm處用酶聯(lián)免疫吸附儀檢測吸光度（OD值）。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測RNA 表達 按照Trizol 提取試劑盒步驟提取星形膠質(zhì)細胞總RNA。采用第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA。根據(jù)RT-qPCR 反應體系配制反應液，并使用實時熒光定量PCR儀自動分析結(jié)果。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃退火30 s 和65 ℃延伸45 s，共40 個循環(huán)。采用2-△△CT法分析目的基因的表達差異。其中，大鼠miR-877 的引物序列為上游：5’-GTAGAGGAGATGGCGCAGGG-3’，下游：5’-CA-GTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 的引物序列為：上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.5 Western blotting 法檢測TLR4、NF-κB、Bax、Bcl-2 蛋白表達的變化 預冷的含有PMSF 的RIPA裂解液（Thermo Scientific）收集并提取星形膠質(zhì)中的總蛋白。使用BCA蛋白分析試劑盒（Pierce）評估蛋白含量。等量的蛋白質(zhì)被加載到10%SDS-PAGE（Thermo Scientific），濃縮膠恒定電壓80 V、30 min；分離膠恒定電壓120 V、60 min。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore）并將膜用TBST 漂洗3次，每次5 min，然后用5%的脫脂奶粉37 ℃緩慢震蕩2 h。分別將膜與初級抗體TLR4（1∶1 000）、NFκB（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）在4 ℃冰箱孵育12 h。PBST清洗后將PVDF 膜與HRP 標記的二抗（1∶10 000）在37 ℃緩慢振蕩孵育l h。TBST 沖洗后，在膜上加入適量的ECL發(fā)光液，利用一體式化學發(fā)光儀拍攝照片。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期 待星形膠質(zhì)細胞鋪滿培養(yǎng)板后，調(diào)整細胞濃度為1×105cells/mL并按照每孔3 mL 培養(yǎng)液接種于6 孔培養(yǎng)板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。細胞經(jīng)胰酶消化后，收集至離心管中，1 000 r/min 離心3 min，棄去培養(yǎng)液。將細胞沉淀用2 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預冷的75%的乙醇，4 ℃固定過夜。1 000 r/min離心3 min棄去固定液，用PBS洗細胞，1 000 r/min，3 min 離心。加入500 μL 含100 μg/mL RNase A 的PBS，37 ℃孵育30 min。30 min 后加入PI 使其濃度為50 μg/mL。避光37 ℃孵育30 min。采用冷PBS溶液洗滌細胞，1 000 r/min下離心3 min。取200 μL的單細胞懸液，上流式細胞儀檢測，CELL Quest 軟件分析。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 棄去孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集，室溫下1 000 rpm離心5 min，收集細胞。用預冷1×PBS 重懸細胞1 次，1 000 r/min 離心5 min，洗滌細胞。加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC 混勻后，避光，室溫孵育15 min。再加入10 μL 的PI 染色，輕輕混勻細胞，于避光條件下室溫孵育10 min。流式細胞儀檢測及分析。

1.8 ELISA檢測炎性因子 收集細胞上清，1 000 g離心20 min，除去雜質(zhì)及細胞碎片，取上清檢測。檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.9 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血紅蛋白與miR-877 對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響 光鏡下觀察星形膠質(zhì)細胞形態(tài)顯示，空白組細胞長勢良好，細胞形態(tài)正常；血紅蛋白組與miR-877 mimic NC 組的細胞間距明顯，細胞皺縮；而miR-877 mimic 細胞形態(tài)明顯改善，接近正常形態(tài)。MTT實驗結(jié)果顯示，與空白組細胞OD值相比，血紅蛋白組OD值下降（P＜0.05）；與miR-877 mimic NC 組相比，miR-877 mimic 組OD 值上升（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組星形膠質(zhì)細胞增殖變化

2.2 血紅蛋白與miR-877 對星形膠質(zhì)細胞細胞周期的影響 與空白組相比，血紅蛋白組、miR-877 mimic NC組的G2/M期細胞比例上升（P＜0.05）；與miR-877 mimic NC 組相比，miR-877 mimic 組G2/M期細胞比例下降（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 各組星形膠質(zhì)細胞細胞周期變化

圖2 各組星形膠質(zhì)細胞細胞周期變化

2.3 miR-877對血紅蛋白誘導的星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響 與空白組相比，血紅蛋白組、miR-877 mimic 組、miR-877 mimic NC 組的細胞凋亡率升高（P＜0.05）；且miR-877 mimic 組低于miR-877 mimic NC組（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組星形膠質(zhì)細胞凋亡率變化

2.4 miR-877對血紅蛋白誘導的星形膠質(zhì)細胞相關凋亡蛋白（TLR4、NF-κB、Bax、Bcl-2）的影響 與空白組比，血紅蛋白組TLR4、NF-κB、Bax蛋白表達水平升高，而Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。而與miR-877 mimic NC 組 相 比，miR-877 mimic 組TLR4、NF-κB、Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組星形膠質(zhì)細胞TLR4、NF-κB、Bax、Bcl-2蛋白表達水平變化

2.5 miR-877對血紅蛋白誘導的對星形膠質(zhì)細胞炎性因子的影響 與空白組對比，血紅蛋白組IL-6、TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.05）。與miR-877 mimic NC 組對比，miR-877 mimic 組IL-6、TNF-α、IL-1β水平下降（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組星形膠質(zhì)細胞IL-6、TNF-α和IL-1β含量變化

3 討論

目前，腦出血是一個較為嚴重的公共衛(wèi)生問題，尚無有效的治療方法[11]。確定腦出血的發(fā)病機制，尋找新的、有效的治療策略具有重要的臨床意義。較多的證據(jù)表明，miRNAs 在腦出血的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12]，針對腦出血中miRNA的研究為其診斷和治療提供了一個新的方向[13]。

腦出血中神經(jīng)元凋亡是腦出血后預后不良的主要原因[14]。miR-877作為一種被廣泛研究的miRNA，Zhu 等[15]發(fā)現(xiàn)其抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白誘導的星形膠質(zhì)細胞增殖水平受到抑制，而促進凋亡的水平，表明在體外成功模擬了腦出血模型。在加入過表達miR-877 后，星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)恢復到正常水平，且細胞活力和增殖情況得到顯著改善，表明miR-877 能夠改善腦出血引起的細胞損傷和死亡，從而起到保護腦神經(jīng)的作用。

細胞表面和內(nèi)體膜上的Toll樣受體（toll like receptors，TLRs）可激活多種宿主防御信號通路，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4 主要在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達[16]?；A研究證實，miR-877/TLR4 通路在膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲中扮演重要角色[17]。另一項研究顯示，miR-877 可通過靶向調(diào)節(jié)TLR4 mRNA 介導膠質(zhì)瘤細胞生長狀態(tài)，并證實miR-877 可抑制包括TLR4在內(nèi)細胞凋亡相關蛋白的表達水平，提高Bcl-2 的表達水平[14]。與本研究miR-877 上調(diào)后TLR4、NF-κB、Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高結(jié)果一致。Toll樣受體下游的NF-κB和IRF途徑可誘導促炎性細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表達，而上述促炎細胞因子在調(diào)節(jié)發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用，其中主要包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和細胞凋亡[18]，現(xiàn)已證實與腦出血、腦卒中等多種疾病的發(fā)生和腦損傷有關[19]。此外，miR-877 已被證實屬于免疫反應、炎癥應答、病毒防御等免疫功能相關的基因表型[20-21]，本研究結(jié)果顯示，血紅蛋白誘導了促炎細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的快速升高，而上調(diào)miR-877 后，IL-6、TNF-α 和IL-1β 等促炎細胞因子含量下降，說明miR-877 參與了星形膠質(zhì)細胞的炎性過程，抑制了細胞炎癥反應，其原因可能與miR-877 抑制TLR4/NF-κB 信號通路TLR4、NF-κB、Bax等蛋白表達，從而降低炎性因子水平和炎癥介質(zhì)瀑布有關。

綜上，miR-877 可抑制由血紅蛋白引起的星形膠質(zhì)細胞炎癥反應，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路有關，有望成為治療腦出血新的靶點。對于miR-877是作用的靶向蛋白尚未發(fā)現(xiàn)，需要進一步實驗來探討其分子機制。