蘇 亞，李小鳳，李 輝

（陜西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710068）

骨質(zhì)疏松癥是臨床常見的一種全身骨代謝疾病，其主要病理特征為骨丟失與骨組織損傷。近年來，我國骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年增加，其發(fā)病原因主要在于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成失去平衡，成骨細(xì)胞分化后可形成骨細(xì)胞最終形成成骨，而氧化應(yīng)激反應(yīng)可造成成骨細(xì)胞損傷[1]。目前關(guān)于骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，長鏈非編碼RNA（LncRNA）在成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)異常并可能發(fā)揮重要調(diào)控作用，已知LncRNA LINC00311 通過Notch 信號通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠中破骨細(xì)胞的增殖和分化[2]。沉默LncRNAANCR 通過靶向EZH2 和RUNX2 促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中成骨細(xì)胞的成骨[3]。LncRNA MALAT1 通過MAPK 信號通路抑制骨質(zhì)疏松大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[4]。已知TMPO-AS1 通過充當(dāng)miR-199a-5p的海綿分子而上調(diào)HIF-1α的表達(dá)并促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[5]。但TMPOAS1 在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用尚未闡明。Nrf2/Keapl 信號通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程，氧化應(yīng)激作用下Nrf2 從Keapl 中釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，其與細(xì)胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合后促進(jìn)抗氧化基因表達(dá)[6]。但TMPO-AS1是否可通過調(diào)控Nrf2/Keapl信號通路而發(fā)揮作用尚未可知。因此，本研究采用地塞米松（Dex）處理人成骨肉瘤細(xì)胞MG63 建立骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞模型，探討TMPO-AS1 對成骨細(xì)胞分化、增殖的影響及其對Nrf2/Keapl信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人成骨肉瘤細(xì)胞MG63購自上海康朗生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自深圳市百恩維生物科技有限公司；胎牛血清、Lipofectamine2000 購自北京索萊寶科技有限公司；地塞米松（Dex）購自北京百奧萊博科技有限公司；pcDNA-NC、pcDNA-TMPO-AS1購自上?？吕咨锟萍加邢薰?；si-NC、si-TMPO-AS1購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑、cDNA 合成試劑與RT-qPCR 試劑購自北京天根生化科技有限公司；CCK-8試劑購自長春市華益生物科技有限責(zé)任公司；兔抗人CyclinD1、ALP、RUNX2、OCN 抗體購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人Nrf2、Keapl抗體購自購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 MG63細(xì)胞置于含有濃度為4 μmol/L Dex的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h[7]，記作Dex組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC 組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將pcDNA-NC、pcDNA-TMPO-AS1、si-NC、si-TMPO-AS1 轉(zhuǎn)染至MG63 細(xì)胞，分別記作pcDNA-NC 組、pcDNA-TMPO-AS1 組、si-NC 組、si-TMPO-AS1 組。分別將pcDNA-NC、pcDNA-TMPO-AS1轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞后加入含有濃度為4 μmol/L Dex 的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記作pcDNA-NC+Dex組、pcDNA-TMPO-AS1+Dex組。

1.2.2 RT-qPCR 檢測細(xì)胞中TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN mRNA 的表達(dá)水平 取NC 組、Dex組、pcDNA-NC組、pcDNA-TMPO-AS1組、si-NC組、si-TMPO-AS1 組MG63 細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36 次循環(huán)。TMPOAS1、ALP、RUNX2、OCN 均以β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 取NC 組、Dex 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-TMPO-AS1 組、si-NC 組、si-TMPO-AS1組、pcDNA-NC+Dex組、pcDNA-TMPOAS1+Dex 組MG63 細(xì)胞（2.5×104個/mL）接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值（OD值）。

1.2.4 Western blotting 檢測CyclinD1、ALP、RUNX2、OCN、Nrf2、Keapl 蛋白表達(dá) 取NC 組、Dex 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-TMPO-AS1 組、si-NC 組、si-TMPO-AS1 組、pcDNA-NC+Dex 組、pcDNA-TMPO-AS1+Dex 組MG63 細(xì)胞加入400 μL RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液與二抗稀釋液，其中一抗稀釋液的稀釋比為1∶1 000，孵育條件：4 ℃條件下孵育24 h；二抗稀釋液稀釋比為1∶2 000，孵育條件：室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在Dex處理的MG63中，LncRNA TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN的表達(dá)水平

與NC組比較，Dex組TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN的表達(dá)水平降低（均P＜0.05），見表1。

表1 在Dex 處理的MG63 中LncRNA TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN表達(dá)水平 ±s

表1 在Dex 處理的MG63 中LncRNA TMPO-AS1、ALP、RUNX2、OCN表達(dá)水平 ±s

與NC組比較，*P＜0.01。

2.2 TMPO-AS1對MG63細(xì)胞增殖的影響

與pcDNA-NC 組比較，pcDNA-TMPO-AS1 組OD 值升高（P＜0.05），CyclinD1 蛋白水平升高（P＜0.05）；與si-NC組比較，si-TMPO-AS1組OD值降低（P＜0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 TMPO-AS1對MG63細(xì)胞增殖的影響

2.3 TMPO-AS1對成骨分化的影響

與pcDNA-NC 組比較，pcDNA-TMPO-AS1 組ALP、RUNX2、OCN 蛋白水平升高（均P＜0.05），與si-NC 組比較，si-TMPO-AS1 組ALP、RUNX2、OCN蛋白水平降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blotting檢測ALP、RUNX2、OCN蛋白的表達(dá)

2.4 高表達(dá)TMPO-AS1 可以逆轉(zhuǎn)Dex 處理的MG63細(xì)胞增殖和分化

與NC 組比較，Dex 組OD 值降低（P＜0.05），CyclinD1、ALP、RUNX2、OCN 蛋白水平降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC+Dex 組比較，pcDNA-TMPOAS1+Dex 組OD 值升高（P＜0.05），CyclinD1、ALP、RUNX2、OCN蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 高表達(dá)TMPO-AS1可以逆轉(zhuǎn)Dex處理的MG63細(xì)胞增殖和分化

2.5 Nrf2/Keapl信號通路相關(guān)蛋白的影響

與NC 組比較，Dex 組Nrf2、Keapl 蛋白水平降低（均P＜0.05）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-TMPO-AS1 組Nrf2、Keapl 蛋白水平升高（均P＜0.05）；與pcDNA-NC+Dex 組比較，pcDNA-TMPO-AS1+Dex組Nrf2、Keapl蛋白水平升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 Western blotting檢測Nrf2、Keapl蛋白的表達(dá)

3 討論

成骨細(xì)胞分化、增殖與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，LncRNA MEG3 通過調(diào)控BMP4 信號傳導(dǎo)而調(diào)節(jié)成骨分化，并參與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過程[8]。LncRNA MEG3 通過靶向miR-133a-3p 抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[9]。LncRNA AK023948 通過PI3K/AKT 信號通路而參與骨質(zhì)疏松發(fā)生過程[10]。但仍有部分LncRNA在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制尚未闡明。

TMPO-AS1 在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的研究相對較少，本研究結(jié)果顯示，Dex誘導(dǎo)的MG63細(xì)胞中TMPO-AS1 的表達(dá)水平降低。已知TMPO-AS1通過調(diào)節(jié)miR-199a-5p/WNT7B 軸作為促進(jìn)骨肉瘤腫瘤發(fā)生[11]。TMPO-AS1通過調(diào)節(jié)miR-320a/SERBP1軸在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮致癌作用[12]。TMPO-AS1通過調(diào)節(jié)TMPO促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[13]。分析原因可能為TMPO-AS1 在不同組織或疾病類型中的表達(dá)趨勢不同，其發(fā)揮作用機(jī)制不同。本研究結(jié)果提示TMPO-AS1 在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物而正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示TMPO-AS1 過表達(dá)可明顯提高M(jìn)G63 細(xì)胞活力，促進(jìn)CyclinD1 表達(dá)，而抑制TMPO-AS1 表達(dá)可明顯降低MG63 細(xì)胞活力，抑制CyclinD1 表達(dá)，提示TMPO-AS1 過表達(dá)可明顯促進(jìn)MG63 細(xì)胞增殖而抑制TMPO-AS1 表達(dá)可明顯減弱MG63 細(xì)胞增殖能力。

ALP 可水解有機(jī)磷酸酶而破壞鈣化抑制劑從而促進(jìn)骨鈣化，即ALP水平升高是鈣結(jié)節(jié)形成的前提條件，RUNX2 是成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，其在非成骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，OCN屬于骨組織中的非膠原蛋白并可反映成骨分化的成熟指標(biāo)之一[15]。本研究結(jié)果顯示，Dex 處理后可明顯降低MG63 細(xì)胞中ALP、RUNX2、OCN 的表達(dá)水平，提示Dex 可抑制MG63細(xì)胞成骨分化。進(jìn)一步分析顯示TMPO-AS1過表達(dá)可明顯提高ALP、RUNX2、OCN 的表達(dá)水平，而抑制TMPO-AS1表達(dá)可明顯降低ALP、RUNX2、OCN的表達(dá)水平，提示TMPO-AS1過表達(dá)可明顯促進(jìn)MG63細(xì)胞成骨分化。同時本研究結(jié)果顯示Dex處理后可明顯降低MG63細(xì)胞活力及ALP、RUNX2、OCN蛋白水平，而TMPO-AS1過表達(dá)后可明顯提高Dex 誘導(dǎo)的MG63 細(xì)胞活力及ALP、RUNX2、OCN蛋白水平，提示TMPO-AS1過表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化。

Nrf2/Keapl信號通路是保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的重要途徑之一，一旦信號通路激活后可明顯促進(jìn)下游基因HO1、NQO1 的表達(dá)從而抑制Dex 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終減輕細(xì)胞損傷[16-18]。本研究結(jié)果顯示，Dex 誘導(dǎo)的MG63 細(xì)胞中Nrf2、Keapl 蛋白水平降低，表明Dex 可能通過抑制Nrf2/Keapl 信號通路的活化從而抑制成骨細(xì)胞增殖及分化，而TMPO-AS1 過表達(dá)可明顯促進(jìn)Nrf2、Keapl 的表達(dá)，進(jìn)一步分析顯示TMPO-AS1 過表達(dá)可明顯提高Dex誘導(dǎo)的MG63 細(xì)胞中Nrf2、Keapl 的表達(dá)水平，提示TMPO-AS1過表達(dá)可能通過激活Nrf2/Keapl信號通路從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化。

綜上所述，Dex 誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞模型中TMPO-AS1 的表達(dá)水平降低，TMPO-AS1 過表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化，其作用機(jī)制與激活Nrf2/Keapl 信號通路有關(guān)，TMPO-AS1 可能作為骨質(zhì)疏松癥治療的重要靶點，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需深入探究。